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本頁は日作紀74に掲載．図表一部省略．
アジサイ属におけるアマチャの特性
藤井敏男1,2)・吉田智彦*,3)
1)みつる植物研究所・2)東京農工大学・3)宇都宮大学）
要旨：アマチャ新品種の育成ならびに栽培法の確立を目指すため，まずアマチャがアジサイ属の中で形態，DNA量，染色体数，分子マーカーなど多方面からみた総合的な特性でどのような特徴を持つのかを知ろうとした．供試品種はアマチャ (Hydrangea macrophylla Ser. var. thunbergii Makino）やアマギアマチャ (Hydrangea macrophylla Ser. var. amagiana Makino) などのアマチャ群の4品種を含むアジサイ属の代表的な25品種である．形態的特性，フローサイトメーターによるDNA量，根端細胞観察による染色体の調査，およびSSR分析を行い，それらにもとづき主成分分析を行った．この結果，アマチャ群の品種を総合的な特性からみると，他のアジサイ属品種と比べて比較的似ており，アジサイ属のなかで特異的ではないことが認められた．しかしアマチャ群の品種間でも染色体数に変異が見られ，また収量を構成する葉数や生育に適する光の強さなど実用上意味のある差異が見られた．アマチャ群の品種間およびアジサイ属品種との交雑や倍数性育種による多収高品質の新品種育成の可能性を示唆した．
キーワード：アジサイ，アマチャ，染色体数，DNA量．
The Characteristics of Amacha varieties in Hydrangea: Toshio Fujii1,2) and Tomohiko Yoshida*,3) (1) Mitsuru Plantech Res. Inst.; 2)Tokyo Univ. of Agr. and Tech.; 3)Utsunomiya Univ., Utsunomiya 321-8505, Japan)
Abstract: For breeding of high yield and high quality cultivars of Amacha (sweet Hydrangea) and establishing the culturing system, the characteristics of Amacha varieties in Hydrangea were studied. Twenty five varieties of Hydrangea including some species, related species and 4 Amacha varieties, as Hydrangea macrophylla Seringe var. thunbergii Makino and Hydrangea macrophylla Seringe var. amagiana Makino, were provided. Several agronomic traits, total DNA amount of a flow-cytometry, number of chromosomes and SSR markers were investigated and principle component analysis including all those data was performed. The results showed that Amacha varieties were comparatively similar to others and were not so exceptionally unique in Hydrangea judging from those all traits integrated. But, there were differences in chromosome number, leaf number and growth suitability for high light intensity even in Amacha varieties. This suggests that it is possible to develop high yield and high quality new cultivars by crossing among Amacha varieties or with other Hydrangea and polyploidy breeding.
Key words: Amacha, Chromosome number, DNA amount, Hydrangea.
アジサイ属（Hydrangea）は東アジア（一部はジャワとスマトラ）と北アメリカ東南部から南アメリカ中部にいたる地域に40数種が分布する（大場 1988）．日本は主要な原産地の一つで，東伊豆や房総，伊豆諸島などに自生するガクアジサイ（ハマアジサイ）と福島県南部から本州全般の山地に自生の見られるヤマアジサイ（サワアジサイ）および北海道南部から東北地方，北陸方面などの裏日本の深雪地帯に自生するエゾアジサイの3グループに分けられる（山本 1981）．ヤマアジサイはガクアジサイに似るが小型で，枝は細く，葉も小さい．葉は光沢なく薄手で山草の趣があり，葉型，花色などにはさまざまな変異がある（山本1981）．ヤマアジサイのなかで葉に甘みのあるものがいわゆるアマチャで，各地で見出されているが，代表的なものとしてはアマチャ（Hydrangea macrophylla Ser.var.thunbergii Makino），アマギアマチャ(Hydrangea macrophylla Ser.var.amagiana Makino)がある（山本 1981）
製品としての甘茶はこれらアマチャ群の品種の葉を発酵調整したもので，含まれるフィロズルチンにより甘味を呈する．古来より甘味料として飲用に供された他，防腐，防カビ作用があるため醤油製造に利用された．さらに，ノンカロリーのため糖尿病患者の甘味料に用いられた他，血液の循環を良くし、身体を温める効果があるため海女に飲用された．また，４月８日の潅仏会に釈迦立像に注ぐ習慣は広く親しまれてきた（西沢 1988，山原ら 1994，村上・吉川 1994）．
しかしその一方で，もともと限られた山間部で伝統的に小規模で生産されてきた甘茶は社会情勢の変化により生産が衰退し，かつては全国の90％を産出し一大産地であった長野県信濃町では一部宗教行事用を除いて今日では生産は皆無となっている．他方，近年肥満や糖尿病の問題は増大し，ノンカロリーを売り物とする清涼飲料が販売されている．こうした中，単にノンカロリーというだけでなく薬効成分を持つ甘茶は，中世より長年にわたって使われてきた安全性とあいまってその価値は再評価されてしかるべきと考えられる．そのためには，これまで本格的には行われてこなかった高品質な甘茶を生産して経済効率を高め，新たな需要を喚起する必要があり，その前提としてまず素材としての高成分含量のアマチャ品種の育成，および栽培法の確立が必要である．
本研究では，わが国が主要な原産地でありながら今日までほとんど不明であるアマチャに関する育種上の基本的な知見を得るため，アマチャ群の4品種を含むアジサイ主要25品種（種の異なるものも含むが，ここでは以後すべて品種と称す）について，形態的特性を調査するとともにフローサイトメーターを用いてDNA量に関する調査を行い，あわせて一部の品種について根端細胞検鏡により染色体数を確認した．また，分子マーカーとしてのSSR分析を行い，さらにそれらの値を総合した主成分分析による解析を試みた．
材料と方法
１．アジサイ属25品種の形態的特性
供試品種を第1表に示す．試験番号1〜12はヤマアジサイ系の品種（1〜4は葉に甘味のあるもので，これらを以後アマチャ群の品種と称す），13はエゾアジサイ系の品種，14〜16は江戸時代からの栽培品種，17〜19はハマアジサイ系の品種，20〜21は育成品種，22〜25は近縁種で比較的身近に見られるものである．なお品種名は大場（1988），木村・木島（1959）やその他の資料（注：財団法人相模原市みどりの協会．園芸豆図鑑特集号あじさい）を参考にした．
2002年7月にみつる植物研究所（栃木県小山市）の品種保存から穂木を採取して，上位から4節目の葉2枚と芽2個を付けて挿し芽を行った（いわゆる管挿し）．
発根後3.5号ポットに移植し，2003年4月に5号鉢に鉢上げした．用土は鹿沼土7：ピートモス3を用いた．その後左右の2芽が揃って伸長し始めたもの各品種2鉢を選び，1鉢づつ2グループに分けて，一方は無遮光区もう一方は晴天時9時〜15時まで70％遮光区のビニルハウス内で養成した．肥料はIB化成 (10-10-10) 大粒を月1回3粒 (約1.5 g) 与えた．灌水は適宜行った．
まず，無遮光区について，生育盛期の2003年9月30日に上位から4節目の葉を採取して葉柄長，葉身長，葉巾，草型（直立かほふくか）を計測した，また落葉後の2004年1月10日に草丈，1次・2次分枝の本数・長さ・節数，1次分枝の上位から４〜５節目の平均節間長，太さを測定した．さらに出芽揃いの2004年3月18日に出芽のタイプ（各分枝の頂芽のみが第1葉の展開を開始する頂芽優先かどうか）を観察し，またそのときの芽数を数えた．
次に，遮光区の生育状況（観察）との比較から強光下で生育の良い品種と弱光下で生育の良い品種に分けた．虫害は両区を通じてハダニの害の多少を観察した．2．気孔の長さとフローサイトメーターによるDNA量
形態調査に用いたのと同じ材料について，葉の裏側2か所にマニキュアで鋳型を作り（吉田・小野 1978），各5個の計10個の気孔の長さを顕微鏡で計測した．
またフローサイトメーター（partec社，プロイディアナライザーPA型使用）でDNA量の調査を行った．フローサイトメーターはDAPI (4，6−ジアミジン−2−フェニールインドール) がDNAと蛍光性の複合体を形成する性質を利用し，蛍光強度とカウントした核数のヒストグラムから相対ＤＮＡ量を測定するものである．上位から４節目の十分展開した葉から約5 mm角を切り出し，シャーレ内で核単離溶液（Nuclei Extraction Buffer Partec社）数滴をたらしカミソリで刻んだ．ナイロンメッシュ（50 μm）でろ過した後，DAPIを含む染色液（Ｓtaining Buffer Partec 社）を約4倍量加え試料１点ごとに測定した．標準液（蛍光ビーズ Ｆluoresbrite Calibration Grade Microspheres 3.0 μm YG Polyscience社）と試料の値から，標準液に対する各試料の比率（index）を得た．
3．根端細胞の観察による染色体数
供試した25品種のうち特徴的な5品種に参考としてヤエカシワバアジサイ（北米原産H.quercifolia）を加えた6点について新梢を挿し，発根した挿し穂2個体から2 cm程度に伸長した根の根端部を長さ約1 cm程度採取し，フォイルゲン反応法により観察した．加水分解は1規定HClで60 ℃10分間とした．観察には1プレパラート当たり2本の根端を用いた．
４．SSR分析
形態調査に用いたのと同じ材料の上位の展開した葉身について，高精度DNAマーカーであり，少量のサンプルでも判別可能なマーカーであるSSR (単純反復配列) の分析を行った．アジサイ属についての分子マーカー知見は不明なところが多いので，ここではAnas and Yoshida (2004) がソルガムの分析で使用した数種のプライマー（Brownら 1996) を用い，その内で明瞭な多型の生じたものについて解析の対象とした．生重約0.1 gから抽出したDNA約20 ngの1/100量を鋳型にサーマルサイクラー (Takara，MP TP3000) を用いて特定領域のDNA断片を増幅した．ポリアクリアミド電気泳動後，DNA断片をイメージスキャナと附属ソフトウエア（Fuji Photo Film， Image Gauge Ver.4.0使用）で読みとった．DNA断片サイズは1 kbマーカーGIBCO/BRLとの相対値で示した．第１図にプライマーSb1-1で増幅されたPCRによるDNA多型の例を示す．268 bpと245 bpでPCR増幅産物の検出されたものを各々1，ないものを0として数値化した．他にプライマーSb1-10で増幅された344 bp，プライマーSb6-342で増幅された308 bpと253 bpの計５つのPCR増幅産物を同様に数値化した．
５．主成分分析
結果
１．形態的特徴
今回の品種特性調査全般の実施状況は，鉢栽培用の培土を用い，2年生苗であったことから，各品種とも露地植え4年生以上の成木に比べて全体的にコンパクトな生育であった．しかし，観察により品種の特性は十分発現されたと考えられた．遮光区ではヤマアジサイ系の品種の生育が良く，無遮光区ではヤマアジサイ系以外の品種の生育が良かったように見受けられた．ここでは無遮光区を中心に結果を述べる（第1，2表）．なお，本試験では品種間差の統計的検定は行っていないので，品種間差の記述については差の明確であるものに限った．
分枝はヤマアジサイ系の品種では主軸の基部から１次分枝が順次増加するのに対し，ヤマアジサイ系以外の品種の１次分枝は2〜3本で，そこから2次分枝が増加する傾向を示した．ヤマアジサイ系では1次分枝の総長が大きかったが，アマギアマチャは2次分枝も極めて多く，総長も大きかった．1次分枝と2次分枝の総節数はアマギアマチャが最も多かった．
節間長はコアマチャが短く，ついでアマチャ，ヤエノアマチャが短くなる傾向であった．分枝の太さは明らかにヤマアジサイ系の品種が細く，直径が5 mmを超えるものは無かった．
葉の大きさはアマチャが長さ，幅とも長かった．草型はアマギアマチャがややほふくした．虫害はハダニの害であるが，総じてヤマアジサイ系の品種の被害が大きく，アマギアマチャでは一部落葉したが，アマチャの被害は少程度であった．
光への反応に関してはアマギアマチャをはじめヤマアジサイ系の品種では遮光区で生育が良く，無遮光区では葉焼けが見られたが，アマチャ，コアマチャ，ヤエノアマチャは無遮光区でも良好な生育を示した．
出芽のタイプは古くからの栽培種とハマアジサイ系がすべて頂芽優先で出芽するのに対し，ヤマアジサイ系はさまざまなタイプが見られ，アマチャは分枝の頂部から基部まで一斉に出芽した．
2．気孔の長さとフローサイトメーターによるＤＮＡ量
気孔の長さはアマギアマチャが長かった．ブルースカイも比較的大きな値であった．
各品種のフローサイトメーターindex値のアマギアマチャの値に対する比で示したDNA量（第2表）によると，試験番号1〜12のヤマアジサイ系の品種はほぼアマギアマチャ並かやや少なかった．しかし，アマチャのみは多く，約1.2倍であった．ブルースカイは1.5倍であった．種の異なるコガクウツギのハナガサは0.8倍，ツルアジサイは0.65倍，アルボレスケンスのアナベルは0.59倍と少ない値であった．
なお，倍数体では気孔の大きさが大きくなり (松尾 1978)，気孔の長さとDNA量とは関係のあることが示唆されたが，ここでの気孔の長さとDNA量の相関係数は0.18であり，両者の間に密接な関係は認められなかった（図省略）．
3．根端細胞による染色体数
アマギアマチャ，マイコアジサイの染色体数は36本が確認されたが，アマチャは36本が多かったものの，極小さな染色体を多数含む46〜50本を越えるものも見られた．ブルースカイは54本であった．また，ヨウラクタマアジサイは30本だったがサイズがもっとも大きく，アナベルとヤエカシワバアジサイは36本だったがサイズは小さく，とくに後者は極めて小さかった（第3表，第2図）．
4．ＳＳＲ分析
第2表に示すとおり，供試番号3，7，11と22が同一のDNA多型を示した．また18と21が同一のDNA多型を，2，13，16と17が同一のDNA多型を，10，15，
19，20，23と24が同一のDNA多型を示した．
5．主成分分析
以上の調査結果のなかの22項目に基づき主成分分析を行った．第2主成分までの累積寄与率は41.3％であった．各品種の第1，2主成分値での散布図（第3図）に示されるように，アマチャ群の品種が特異的に集まることはなく，アジサイ属品種に広く分布する傾向を示した．
考察
1．アジサイ属におけるアマチャの特性
アマチャ群の品種はヤマアジサイの中で葉に甘味成分を持つものとされてきた．このわが国原産のヤマアジサイはハマアジサイ，エゾアジサイとともにアジサイ属のなかで主要な品種であり，これらはヨーロッパへ渡り，いわゆる西洋アジサイの母本となった（山本 1981）．今日でもアメリカ，日本等も含めたすべての育成品種はこれらの後代から得られたものである．今回，アマチャの研究を開始するにあたり，若干の他の品種も加え形態的特性と染色体に関する調査を行った．染色体に関する調査はCerbahら （2001) が同じくフローサイトメーター等を用いて研究を行っているが，形態的特性を含めて行った研究は本報が初めてである．
ヤマアジサイ系の品種は総じて枝が細く，分枝は幹の基部から出やすく，弱光下で良く成育し，ダニ害は受けやすかった．アマギアマチャの葉は細長く，分枝数，節数，芽数とも極めて多かった．一方，アマチャは枝が太く，葉も大きく，強光下でも良く成育し，出芽が頂部から基部まで斉一に始まった．
なお，ブルースカイは枝が極めて太く，頑健な様子を呈した．近縁種ではコガクウツギのハナガサは枝が細く，葉も小さかった．ヨウラクタマアジサイは葉に剛毛があり，ツルアジサイはツル状を呈し，いずれもいわゆるアジサイ離れしていた．アナベルは強光下で良く生育し，ヤマアジサイ，ハマアジサイと似た形態を示した．
フローサイトメーターを用いて調べたＤＮＡ量はヤマアジサイ系の品種が少なく，アマチャのみが多かった．このことは根端細胞の観察結果による染色体数がアマギアマチャやマイコアジサイがCerbahら (2001) と同様2x＝36であったのに対し，アマチャの染色体数は36に加え，約46〜50と多いものがあったことと関連するものと考えられる．その他ではブルースカイがアマギアマチャの約1.5倍量あり，根端細胞の観察の結果，3倍体の3x＝54であることが分かった．
SSR分析結果は，アマギアマチャとシチダンカ，ベニヤマアジサイ，ハナガサが同一グループでアマチャとは異なった．また，コアマチャはヒメアジサイ，クロジクアジサイ，ハナビアジサイと別のグループを形成し，ヤエノアマチャも他品種と異なり，アマチャ群の品種同士でグループを形成することはなかった．
さらに大きな見地からアジサイ属におけるアマチャ群の品種の位置づけを知るために，主要22項目に基づいて主成分分析を行って得た第1，第2主成分のグラフから判断すると，アマチャ群の品種がグラフ内に特異的に集まることはなく，今回供試した他の品種と似ており，特異的ではないことが明らかとなった．
2．高品質甘茶生産のための方策
以上述べたとおり，アマチャ群の品種がアジサイ属の中で葉の甘味以外特に変わった特性を持つものではないことがわかった．
アマギアマチャはアマチャ群の品種の中で特に甘いとされるが，枝は細く株はほふくし，ハダニの害も受けやすいところから，圃場での栽培には適さないと判断された．一方，長年にわたって栽培されてきたアマチャはヤマアジサイ系品種の中では枝が太く，葉が大きく，出芽も斉一でハダニの害も見られず，強光下で良く成育した．これは本来野生種であったアマチャが長期にわたる栽培現場での選抜の結果として栽培化したことを示唆する．
今後は，アマギアマチャとアマチャ，ヤエノアマチャ，ブルースカイ等との交雑や，3倍体化を含め，アマギアマチャの栽培性を改善するとともに，高成分含量の品種育成の必要性があると考えられる．
謝辞：アジサイ全般にわたる基礎的知見を御教授賜るとともに多くの貴重な品種を御恵与下さいました故山本武臣氏に深甚なる感謝の意を表します．また，フローサイトメーターの使用を快く許可されました栃木県農業試験場生物工学部長小林俊一氏にお礼申し上げます．さらに，染色体数の確認にあたりご指導くださいました宇都宮大学房相佑博士，ならびにSSR分析に際しお世話くださいました宇都宮大学Anas博士に謝意を表します．加えて長野県信濃町におけるアマチャ品種の採集にあたり現地の案内や所有者との交渉など全般をお取り計らい下さいました前信濃町教育委員の駒村俊敬氏に厚くお礼申し上げます．
引用文献
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Brown, S.M., M.S.Hopkins, S.E.Mitchell, M.L.Senior, T.Y.Wang, R.R.Duncan, F.Gonzales-Candelas and S.Kresovich 1996. Multiple methods for the identification of polymorphic simple sequence repeats (SSRs) in sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench]. Theor. Appl. Genet. 93: 190―198.
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山本武臣 1981．アジサイの話．八坂書房，東京．17―18．
吉田智彦・小野敏忠 1978．ニ・三の環境条件が稲葉身気孔密度に及ぼす影響．日作紀 47：506―514．
図表のタイトル，注一覧
第1表 アジサイ属品種の形態的特性値．
草型は1：直立，3：中，5：ほふく．総芽数は2004年3月18日時点での出芽数．材料は無遮光区のものである．
第2表 アジサイ属品種の形態以外の特性値．
虫害（ハダニの害）は1：少，3：中，5：多．光は1：弱光で生育良，3：中，5：強光で生育良．出芽斉一度は1：頂芽優先，2：中，3：頂芽から下位節まで均等に出芽開始．DNA量はフローサイトメーターによるindex値で対アマギアマチャ比．気孔長さで混は大小が混在．SSRは1；プライマーSb1-1による268 bp，2：同245 bp，3：同Sb1-10による344 bp，4：同Sb6-342による308 bp，5：同253 bpバンドの有(1)無(0)．材料は，虫害が遮光区と無遮光区をあわせたもの，光が遮光区と無遮光区の比較によるもの以外，無遮光のものである．
第3表 アジサイ属品種の染色体数と大きさ．
アマチャには極小さなものを含み，46〜50数本のものも見られた．
第1図 アジサイ属品種におけるSSRによるDNA多型検出．
番号は品種の番号．第1表を参照．
第2図 アジサイ属品種の染色体（左からアマチャ，アマギアマチャ，ブルースカイ）．
第3図 アジサイ属品種の主成分分析結果．■はアマチャ群の品種．
以上