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本頁は農業教育学会誌に掲載．図表省略．
亀井忠文・吉田智彦・和田義春 Conservation and Multiplication of Endangered Plants in Yamanashi Prefecture and Its Application for Teaching in Agricultural High School W Establishment of Multiplication system for Kitadake-denda（ Woodsia subcordata Turcz.） from Southern Japanese Alps by Aseptic Culture Tadafumi Kamei, Tomohiko Yoshida and Yoshiharu Wada Summary Multiplication system for Kita-dake-denda (Woodsia subcordata )from Mt.Kita-dake,Southern Jananese Alps by aseptic spore culture was studiesd. It was sterilized the surface with a NaClO solution, and a feather piece including the sporangium of non-cleavage was cultured. Spore germination, prothallium formation, sporophyte formation and germination of plantlet were invesugated in plant hormone-free MS medium. The prothalliums gathered and formed a cluster. acclimation did not have any problem by the method of the previous report (Kamei et al.,2008 ). It was established an increase system of the stability. But it took a culture period more than eight months, and shortening of the culture period seemed to be a problem. In addition, this study was aimed for the teaching materials in extracurricular education (students activities ) and wrestled. KeyWors: EndangeredPlants,Woodsiasubcordata,Fern,Aseptic culture,Applicationfor teaching 要旨 南アルプス北岳産キタダケデンダ（ Woodsia subcordata） の株から未裂開 の胞子嚢をもつ葉を採集し， 無菌的な胞子発芽による大量増殖法の開発 を行った。胞子嚢を含む羽片をNaClO水溶液で表面殺菌し培養した。培 地はMurashige & Skoog（ 1962） の処方を基本として， これに植物ホル モンを添加し胞子発芽， 前葉体形成， 胞子体形成および個体獲得状況の 調査を行った。実験の結果， 胞子発芽， 前葉体形成， 胞子体発生および 個体獲得ともに植物ホルモン無添加のＭ Ｓ 培地で好成績が得られた。前 葉体は集まって集塊を形成した。馴化は前報（ 亀井ら2008） の方法で問 題なかった。安定的な増殖体系を確立できた。ただし， 培養期間が８ か 月以上かかり， 培養期間の短縮が課題と思われた。 なお， この研究は特別活動（ クラブ活動） における教材化を目的とし て取り組んだ。 キーワード： 絶滅危惧植物， キタダケデンダ， Woodsiasubcordata， シダ， 無菌培養， 教材化 緒言 著者らは南アルプスの絶滅危惧植物の保全・増殖技術の農業高等学校 専門科目における教材化の研究を進めており，既にマンテマ属（ SileneL.） ２ 種， ツリガネニンジン属（ AdenophoraFischer） ２ 種について報告した（ 亀 井ら2008； 2009； 投稿中a, b ）。 本報では， 南アルプスに稀産する高山性シダ植物キタダケデンダ （ Woodsia subcordata Turcz. ） の組織培養法（ 無菌的な胞子散布） による増殖 系を検討した。 キタダケデンダは，イワデンダ科（ Woodsiaceae）イワデンダ属（ Woodsia R.Br. ） の夏緑性シダ植物で， 北海道と南アルプス・八ヶ岳に分布し， 高 山帯の岩の割れ目に稀に生じる（ 岩槻1999）。ヒメデンダの別名をもつ。 キタダケデンダは， 1930年大井により南アルプス北岳産の標本をもとに W.kitadakensisOhwi として記載されたが（ Nakaike 1975）， 近年ではアジア北 東部に知られているヒメデンダW.subcordataTurcz. と区別しないとする見解 が一般的とされる（ 光田1979）。和名はキタダケデンダ（ 別名・異名と してヒメデンダを併記） とし， 学名はW.subcordata をあてる場合が多いよ うである（ 岩槻1999； 豊国1998； 大場・高橋1999）。本種は環境庁2000 年版レッドデータブック（ 環境庁編2000） で絶滅危惧T Ａ 類（ Ｃ Ｒ ） に ランクされ， これによれば我が国で知られているキタダケデンダの生育 地は７ 地点あり， 現在このうち既に北海道・静岡県内の３ 地点が「現状 不明」， 他の山梨・群馬・長野各県の４ 地点でも「それぞれ数株が確認 されているだけ」で，「株の採集によって消失するおそれがある」とし ている。絶滅危険性の主な原因として園芸採取があげられている。北岳 山頂直下の岩場に辛うじて残存するこの植物を， 一部の心ない山草マニ アが， いつ根こそぎ持ち去るかも知れない厳しい状況にあり， 絶滅の危 険性が非常に高い種といえる。山梨県稀少野生動植物種の保護に関する 条例（ 山梨県2007） で特定野生動植物種とされている。 本種はもとより希少高山性シダの保全や増殖に関する報告は見あたら ず本報が初の報告となる。 なお， この実験は山梨県の農業高等学校の特別活動（ クラブ活動） に おける地域の絶滅危惧植物の教材化の一環として行った. 材料および方法 １ . 無菌培養系の確立 本種の無菌的な胞子散布による増殖については， 2000年山梨県高山植 物保護条例の規定に基づき園芸店で購入した個体をもとに試みた。この 実験結果を追試するため， 2008年８ 月， 環境省および山梨県の許可を得 て南アルプス北岳山頂付近において， 未裂開の胞子嚢のついた本種の羽 片を採取し， 持ち帰って実験に供した（ 第１ 図）。当初予備的に， ミズ ゴケ上に胞子を散布・発芽させる方法を試みたが， ほとんど発芽しなか ったので無菌胞子散布に切りかえた。裂開前の胞子嚢を持つ若い葉片を 適宜切り取り，次亜塩素酸ナトリウム（ NaClO）水溶液（ 有効塩素0.1％ ） で10分間攪拌， 表面殺菌した後， クリーンベンチに持ち込み， 滅菌水で 洗浄した。葉片を無菌的に５ mm四方程度の大きさに調整し， 葉の裏の胞 子嚢を上にして培地に置床した。 基本培地はMurashige ・Skoog （ 1962） の処方（ 以下「Ｍ Ｓ 処方」） を用 いた。供試培地は植物ホルモン無添加およびＢ Ａ （ N6-Benzyladenine） をそれぞれ0.1, 0.5, 1.0,2.0 mg/lの濃度で含む計５ 区に置床し， 胞子 の発芽状況を調査した。なお胞子の発芽は,葉（ 羽片） の胞子嚢上に緑 点が現れたものとした。各区フラスコ20本ずつ供試した。調査は２ か月 後に行った。培養条件は， 温度22± 2℃ ， 日長24時間， 照度3000 lxとし た（ 本研究の他の実験もすべてこの条件で実施）。 ２ .前葉体の形成 シダ植物の配偶体である前葉体を得るために， 葉片上に緑色に発芽し た胞子群をかき取り， １ .と同様の培地に継代培養した。各区20片試し た。調査は２ か月後に行った。 ３ .胞子体の形成 ２ .で得られた前葉体の集塊から， シダの本体である胞子体を得るた め， 直径３ cm程度の集塊をフラスコに継代培養した。この際， １ 個の集 塊を１ フラスコ分とし， 培地成分の吸収がよいように， ばらばらにして 培地面に散らばした。１ .と同様の培地とし， 幼植物体（ 胞子体） 形成 程度を調査した。調査方法は, 前葉体集塊上に発生した羽片（ 栄養葉） の枚数を数え比較した。各区20個試した。調査は３ か月後に行った。 ４ .個体の獲得 ３ .で得た胞子体を摘出・分離し， 発根した個体を得るための継代培 養を行った。培地は， Ｍ Ｓ 処方を基本とし,Ｂ Ａ 0,0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/lの各濃度と， 一般的に発根に有効なオーキシンとしてＮ Ａ Ａ （ α - Naphthaleneacetic acid） を0,0.1, 0.5 mg/lの各濃度で組み合わせた12区 とし， 発根状況を調査した。調査方法は, 長さ10mm以上の根の本数を数 え比較した。各区20個供試した。調査は１ か月後に行った。 また， 馴化について検討した。馴化は室内にて行った。再生個体を用 土を詰めたプラグトレイに植え付けてイチゴパックで覆い湿度を十分保 ちながら常温で行った。用土は前報（ 亀井ら2008） と同様のものを用 いた。再生個体を10日後覆いを撤去し通常栽培に移行， その１ 週間後， 活着状況を見きわめた。 ５ .クラブ活動における教材化 本種は培養期間が長期に及ぶことが既に分かっていたので, 特別活動 の中で取り組むこととし, 本校植物研究部（ クラブ活動） における教材 化を図った。具体的には, 本種の増殖技術の確立をテーマとする研究計 画を立て取り組んだ。 結果 １ . 無菌培養系の確立 無菌培養による培地組成別の胞子の発芽状況は第２ 図のようであっ た。胞子の発芽はどの区でも観察された。このうち， 植物ホルモン無添 加区が20本中14本と最も良好だった。Ｂ Ａ 0.1mg/l添加区でも効果がや や認められた。発芽のようすを第３ 図に示す。 ２ .前葉体の形成 どの区でも前葉体の形成が観察された。胞子は自然環境では， 普通個 々に前葉体を生じるが， 試験管内では第４ 図のように集合して塊状にな った。これをここでは仮に「前葉体集塊」と呼ぶこととした。発芽した 胞子から継代培養した結果は第５ 図のようだった。前葉体集塊の形成は， １ .と同様， Ｍ Ｓ 処方の植物ホルモン無添加培地で20本中12.5本と最も 良好であった。Ｂ Ａ 添加各区でも少々効果が認められた。 ３ .胞子体の形成と大量増殖 ２ .で得た前葉体集塊を植物ホルモン無添加培地で培養を続けると， 置床２ か月経過後頃より， 第６ 図のように， 集塊表面に幼植物体（ 胞子 体） を生じるようになった。そこで， 前葉体集塊を培地面に散らばし， 幼植物体形成条件を植物ホルモンの面から探ることにし， ３ か月後観察 したところ， 第７ 図の結果を得た。このことから， 植物ホルモン無添加 区で胞子体の形成が,平均10.7本と最も良好だった。 ４ .個体の獲得 前葉体集塊上に形成された胞子体を分離し， 発根した個体を得るため に継代培養を行ったところ第８ 図の結果を得た。発根および個体獲得も Ｍ Ｓ 処方， 植物ホルモン無添加区が平均11.3本と最も最も成績良好だっ た。Ｎ Ａ Ａ による発根効果はＢ Ａ 無添加の時, 各区で認められた。その 他の区では効果が小さかった。馴化用土は問題なかった。第９ 図は馴化 を終え,栽培に移行した個体のようすである。 ５ .クラブ活動における教材化 第１ 表のとおり研究計画を作成した。第10図は本校植物研究部員によ る無菌操作の様子である。 考察 シダの増殖は従来株分けや胞子散布によっていたが， これらの方法は 増殖率が低く， 近年ではさまざまな外植体を用いた無菌培養による増殖 が一般的になってきた。樋口・雨木らのグループはタマシダNephrolepis cordiforia ， シマオオタニワタリAsplenium nidus ， イノモトソウPteris ensiformis ， アジアンタムAdiantum raddianum 等について， 根茎を外植体に用い， Ｂ Ａ 添加で誘導される多芽球体を利用する大量増殖系を確立した（ 樋口ら19 85,1986； ;Higuchi,H.ら1987； 雨木ら1989,1990； Amaki,W.ら1991）。L effringら（ 1982） はセイヨウタマシダNephrolepis exaltata の５ 品種のラン ナーの培養を試み， 培地組成は1/2濃度Ｍ Ｓ 処方＋ Ｉ Ａ Ａ 0.3〜 0.5mg/l 添加でよいことを示した。那須野ら（ 1991） はＢ Ａ で誘導したPteris の 多芽球体を１ か月ごとに継代培養したところ５ 回までは生長率が高まっ たが９ 回以降は低下したという。この他にランナー起源の多芽球体を利 用したクサソテツMatteuccia struthiopteris （ 井内ら1999） の植物体再生の報告 などがある。無菌的な胞子培養では， 例えばゼンマイOsmunda japonica の 報告（ 橋本1989） があり， 胞子から前葉体生育までは1/4濃度Ｍ Ｓ 処方， それから幼植物体発生までは1/2濃度Ｍ Ｓ 処方（ いずれも植物ホルモン 無添加） で成績良好だったという。また， 亜熱帯の木性シダであるヒカ ゲヘゴCyathea lepifera の報告（ Kuriyamaら2004） では， 培地に添加したシ ョ糖は前葉体の増殖を飛躍的に高めるが， 胞子体形成には効果がなく， Ｍ Ｓ 基本培地（ ショ糖無添加） を1/10,1/20,1/40,1/80と希釈すること により胞子体が形成されたという。 著者らはこの研究で， キタダケデンダの無菌胞子培養による個体再生 および大量増殖法を完成した。まず， NaClO水溶液による葉片の表面殺 菌法は， 胞子の発芽状況から問題ないと思われた。胞子発芽から胞子体 形成までＭ Ｓ 処方を基本とする植物ホルモン無添加培地で定期的に継代 培養すればよいことが分かった。この培養系は， 胞子発芽まで２ か月， 前葉体形成まで２ か月， 胞子体出現まで３ か月， さらに個体獲得まで１ か月の計８ か月を要した。培養期間の短縮が今後の課題である。これで 本種の当面の技術的な絶滅回避策は確立できたと考える。他の種でよく 観察される多芽球体の発達はあまり見られず,今後大量増殖手段として 多芽球体の形成条件を探る必要があると思われた。 なお，種子植物の保全を考える場合は種子繁殖法の確立がたいせつで， 単なる組織培養による大量増殖だけでは， 遺伝資源保全のための万全な 方法とはなり得ないが， キタダケデンダのようなシダ植物では， 安定的 な胞子繁殖の確立が即， 保全技術につながるといえる。本報で提示する この体系は， 実用性のある有益な手法であると考えられた。また， この 方法では外植体として葉の一部があればよく， 根茎を用いる場合と違っ て個体を株ごと抜き取る必要がないため， 現地に生育する個体保護の観 点からも適切と考えられた。 シダの通常の野外における生活史と試験管内の状態の比較をしておき たい。シダの一般的な生活史は，配偶子（ 卵と精子）をつくる配偶体（ ｎ 世代） と胞子をつくる胞子体（ シダの本体、２ ｎ 世代） が互いに独立し ており， はっきりした核相交代（ 世代交代） が見られる。胞子体の葉裏 の胞子嚢には減数分裂により胞子ができる。落下した胞子は発芽して直 径数mm程度の苔のような配偶体（ 前葉体） を形成し， その裏側に造卵器 と造精器ができ， やがて卵と精子がつくらる。精子は雨の日などに水分 を頼って卵に泳ぎ着き， 受精して胚（ 幼植物体） を生じる。これがやが て生長してシダの本体（ 胞子体） になる。試験管内においても， もちろ んこの基本的な生活の営みは異ならない。ただし， 温度・光・湿度・栄 養分等の環境が人為的に制御された特殊な環境下にあるため， 少々ふる まいが違う点がある。まず， 培地に置床した葉片上の胞子は緑の塊とな って一斉に発芽した。そして， やがて前葉体を形成したが， その状態は 集合して塊状になることが確認され， これを仮に「前葉体集塊」と呼ぶ ことにした。胞子の一斉発芽は， 温度・湿度が好条件のための現象と思 われた。狭い試験管内に各々が前葉体を形成するため， 結果として集塊 状になるものと考えられた。この前葉体集塊からの幼植物体形成に， 意 外と時間がかかるのは（ ３ か月程度）， その密集状態が原因と思われた。 つまり， 互いに重なっているため， かなり多湿と思われる試験管内にも かかわらず，細かい隙間には、精子の泳動に十分な水分が入っていかず， 受精の障害になっているものと推察される。現に実験では前葉体集塊を ばらして培地面に薄く広げたところ， 胞子体（ 幼植物体） を生じるよう になった。この操作を胞子の発芽後早い時期に実施することが重要と思 われた。 さて， 環境庁（ 2000）『レッドデータブック』は， 絶滅の危機に瀕す るシダ植物として， 絶滅危惧T Ａ 類82種， 同T Ｂ 類48種をリストしてい る。このように多数の種に及ぶのは， シダは受精に水の媒介が必要で， 土壌水分や空中湿度など生育環境が非常に限定されるためと思われ， こ の数字はそれぞれの種の生育環境が乾燥化など相当悪化が進んでいるこ とを示しているものと推察される。本研究の結果は， これらの種の保全 ・増殖に応用可能であると考えている。今後， 当面山梨県における絶滅 危惧種， 例えばクモイカグマPolystichum lonchitis（ 別名ヒイラギデンダ； 絶滅危惧T Ａ 類） 等への適用を考えていきたい。 シダの教材化に関する研究は高等学校における教科「理科」の生物教 育の中で広く行われている。生活環の教材化を試みた例が多く， 生活環 の視覚化（ 例えば渡邉ら1995,1998）， 生活環の観察（ 例えば菊池1986 ； 安田1988； 高宮1988； 渡邉ら1993,1994） などである。増殖系を教材 とした研究は少なく， 例えばシロヤマゼンマイの無菌培養系の確立（ 川 上ら2004） の報告などがある。シダの絶滅危惧種の保全・増殖技術の教 材化に言及したものは見あたらない。 キタダケデンダの教材化について考える。本種は培養に長期間を要す るため， 実験の一連の流れや生長の過程を連続的に捉えにくいので， 教 科としてではなく特別活動（ クラブ活動） の中の１ つのテーマとして取 り組むことは適当であったと思う。実験過程において， 野外では目に触 れにくいシダの胞子発芽， 前葉体形成， 胞子体の生長まで生活環を視覚 的に間近で捉えることができ， シダの生活を理解する上でもよい教材と 思われた。また， 地域の絶滅危惧植物の保全や大量増殖が， 生徒たちが 日々実践している園芸植物の組織培養の手法を援用できることに気づか せることができた。 謝辞 調査に同行いただいた石川啓吾氏（ 石川生態環境計画代表） に感謝申 しあげる。 引用文献 １ ） 亀井忠文・吉田智彦（ 2008） 山梨県における絶滅危惧植物の保全お よび増殖技術の開発とその教材化（ 第１ 報） 南アルプスにおけるマ ンテマ属絶滅危惧植物の教材化. 日農教誌.39： 33-42. ２ ） 亀井忠文・Ly Tong・和田義春・吉田智彦（ 2009） Ｄ Ｎ Ａ マーカー を利用した南アルプスの絶滅危惧植物タカネビランジ（ Silene akaisialpina ） における鳳凰三山と北岳産個体の識別とその教材化. 日 農教誌.40：（ 印刷中） ３ ） 亀井忠文・吉田智彦山梨県における絶滅危惧植物の保全および増 殖技術の開発とその教材化（ 第２ 報） タカネビランジの受粉様式の 解明とタカネマンテマの組織培養による大量増殖系の確立. 日農教 誌.（ 投稿中a） ４ ） 亀井忠文・吉田智彦山梨県における絶滅危惧植物の保全および増 殖技術の開発とその教材化（ 第３ 報） 南アルプス産ツリガネニンジ ン属（ Adenophora Fischer） ２ 種の組織培養による増殖法の検討. 日農教誌.（ 投稿中b） ５ ） 岩槻邦男（ 1999） 日本の野生植物シダ. p.226. 平凡社. 東京. ６ ） Nakaike T. （ 1975） Enumeratio Pteridophytarum Japonicarum Filic ales. Univ.Tokyo Press. Tokyo. p.311. ７ ） 光田重幸（ 1979） ヒメデンダとキタダケデンダ. 植物分類・地理. 30： 99-100. ８ ） 豊国秀夫（ 1998） 日本の高山植物. 山と渓谷社. 東京. p.655. ９ ） 大場達之・高橋秀男（ 1999） 日本アルプス植物図鑑. 八坂書房. 東 京.p.181. 10） 環境庁編（ 2000） 我が国における絶滅のおそれのある野生生物− レ ッドデータブック− ８ （ 維管束植物T ） .660pp. 11） 山梨県（ 2007） 山梨県稀少野生動植物種の保護に関する条例（ 平成 19年山梨県条例第34号） . 12） Murashige T. and Skoog F.（ 1962） A revised medium for rapid growth and bioassays with tabaccotissueculture.Physiol.Plant.15:473-497. 13）樋口春三・鈴木重俊・玉井悟・雨木若慶（ 1985）. Nephrolepis cordiforia Presl. (タマシダ)の組織培養による増殖. 園学要旨.昭60秋:394-395. 14） 樋口春三・雨木若慶・金杉勝（ 1986） . Asplenium nidus L. の組織培養 による増殖. 園学要旨.昭61秋:328-329. 15） 雨木若慶・樋口春三（ 1989） . Pteris ensiformis cv. ‘ Victoriae ’（ フイリ イノモトソウ） の組織培養による増殖. 園学雑.58(別2):514-515. 16） 雨木若慶・樋口春三（ 1990） . Adiantum raddianum cv. ‘ Fritz-luthii ’ の組 織培養による増殖. 園学雑.59(別2):646-647. 17） Higuchi,H.,Amaki,W.and Suzuki,S.（ 1987） In vitro propagation of Nephrolepis cordiforia Presl. Scientia Hortic. 32:105-113. 18） Amaki,W.and Higuchi,H.（ 1991） A possible propagation system of Nephrolepis, Asplenium, Pteris,Adiantum and Rumora (Arachniodes ) through tissue culture. Acta Hortic. 300:237-247. 19） Leffring,L.and A.C.Soede（ 1982） Influence of salt concentrat ion on the homogenity of Nephrolepis plants from tissue culture. Proc.5th Intl.Cong.Plant Tissue & Cell Culture(Plant Tissue Culture 1982):499-500. 20） 那須野健・雨木若慶・樋口春三（ 1991） Pteris 培養増殖系における 多芽球体の生長と幼植物体再生に及ぼす継代回数の影響.園学雑.60 (別2):502-503. 21） 井内美砂・後藤昭文・川村泰史（ 1999） クサソテツの大量増殖（ 第 ２ 報） 多芽球体の誘導および植物体再生.徳島農試研報.第35号:14- 19. 22） 橋本聖一（ 1989） ゼンマイの試験管内増殖に関する研究.園学雑.58 (別1):214-215. 23） Kuriyama,A.,T.kobayashi and M.Maeda（ 2004） Production of sporophytic plants of Cyathea lepifera, a tree fern, from in vitro cultured gametophyte. J. Japan. Soc. Hort. Sci. 73:140-142. 24） 渡邉重義・池田秀雄（ 1995） ビデオ教材「シダ植物の生活環」の授 業実践における利用. 生物教育.35(1):53-54. 25） 渡邉重義・Treyes,Rodolfo S.・池田秀雄（ 1998） シダ植物の有性 生殖の教材化U . 生物教育.38(3):131-138. 26） 菊池永枝子（ 1986） 多目的利用をかねた生活環教材の開発２ シダ植 物− 発芽から前葉体まで. 遺伝.40(5):60-65. 27） 安田啓祐（ 1988） シダ類の配偶体世代の観察. 遺伝.42(3):13-18. 28） 高宮正之（ 1988） ゼンマイを用いた核相交代の観察. 遺伝.42(3): 19-24. 29） 渡邉重義・池田秀雄（ 1993） 身近な材料を用いたシダ植物の生活環 の観察： 前葉体を中心とした教材性の比較. 日本理科教育学会全国 大会要項.(43):195. 30） 渡邉重義・池田秀雄（ 1994） シダ植物の有性生殖の教材化１ − 固定 した材料を用いた生活環受精現象の観察.生物教育.34(4):307-313. 31） 川上敏行・池田秀雄（ 2004） シロヤマゼンマイの培養系の確立とそ の教材としての有効性の検討.生物教育.44(2):68-76.以上