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本頁は農業教育学会誌に掲載．図表省略．
亀井忠文・吉田智彦・和田義春 要旨 南アルプス産絶滅危惧種のヒメシャジン（ A d e n o p h o r a n i k o e n s i s ） およびホウオウシャジン（ A . t a k e d a e M a k i n o v a r . h o z o w a n a ） の２ 種に ついて保全や増殖技術の確立を目的として， 組織培養による大量増殖系 の確立を検討した。 ヒメシャジンの組織培養による大量増殖系を確立した。外植体からの シュート発生は， Ｍ Ｓ 処方を基本培地としてＢ Ａ 0 . 5 m g〜 1 . 0 m g / l 添加が 有効だった。シュート塊の誘導には， Ｂ Ａ 0 . 5 m g / l 添加区が優れ， 継代 培養を繰り返すことで順調に増殖した。不定根誘導は， 植物ホルモン無 添加培地で容易にできた。順化・屋外栽培は容易だった。 ホウオウシャジンの組織培養による個体再生系を確立した。外植体か らのシュート発生およびシュート塊形成にはＭ Ｓ 処方にＢ Ａ 0 . 5 m g / l 添 加区で優れた。不定根誘導は植物ホルモン無添加培地でよかった。本種 は培養による増殖がヒメシャジンより緩慢であった。順化・屋外栽培は 今後の課題である。本種の個体再生系は完成できた。 なお， この研究の結果をもとに， 科目「課題研究」への教材化を図っ た。 キーワード： ツリガネニンジン属（ A d e n o p h o r a ）， 組織培養， 絶滅危惧植物， 教材化， 農業高等学校 緒言 著者らはこれまで南アルプス産の絶滅危惧植物の保全および増殖技術 の開発と農業高等学校における教材化に取り組み， 既にナデシコ科のタ カネビランジ（ ） とタカネマンテマ（ ） につ いて種子の休眠打破法・大量増殖法・平地における栽培条件などを明ら かにし， その教材化を図った1 , 2 ）。 本報では南アルプス産絶滅危惧種のヒメシャジン（ A d e n o p h o r a n i k o e n s i s F r a n c h . e t S a v a t .） およびホウオウシャジン（ A . t a k e d a e M a k i n o v a r . h o z o w a n a ( T a k e d a ) S u g i m o t o ） の２ 種について組織培養による大量 増殖系の確立を検討し， 教材としての有効性を探ったので報告する。 上記２ 種はキキョウ科（ C a m p a n u l a c e a e ） ツリガネニンジン属（ A d e n o p h o r a F i s c h e r ） に分類される。本属植物はアジア・ヨーロッパに約5 0 種， 我が国には1 1 種（ 下位の分類群を除く） 程度が知られている3 , 4 )。 ヒメシャジンは， 本州中部以北の亜高山帯から高山帯の岩礫地や岩の 間に生える多年草で， 山梨県内では南アルプス・八ヶ岳・富士山・秩父 山地に分布している５ , 6 )。山梨県高山植物の保護に関する条例（ 年月日 施行， 年月日廃止） で「特定高山植物」2 2種の１ つに指定されたが， こ の条例を引き継ぐ現行の山梨県希少野生動植物の保護に関する条例7 ) （ 年月日施行； 以下「県条例」という） では指定から外れた。しかし， 指定の有無にかかわらず本種は各地において極限的に分布し希少種であ ることにはかわりない。南アルプスにおいては， 鳳凰三山の砂礫地など で見られる。 ホウオウシャジンは， 母種イワシャジン（ A . t a k e d a e M a k i n o ） の高山 型とされ， 南アルプスの鳳凰三山の花崗岩の岩隙に見られる希少種で他 の地からの記録はない4 , 8 )。フォッサマグナ要素の植物として植物地理 学的な重要性も指定されている9 , 1 0 ）。環境庁2000 年版レッドデータブッ ク1 1 )で最上位のカテゴリー“ 絶滅危惧T Ａ 類（ Ｃ Ｒ ）” にランクされ， きわめて絶滅の危険性が高い。県条例指定種である。著者らの観察では， 現地における本種個体は稀に散見される程度である。 上記２ 種を含むツリガネニンジン属植物の保全や増殖に関する先行研 究は一切見あたらない。 本報においては， この２ 種の保全や増殖技術の確立を目的として， 組 織培養によるヒメシャジンの大量増殖とホウオウシャジンの個体再生に ついて検討した。 なお， この研究は前報につづき， 山梨県の農業高等学校における地域 の絶滅危惧植物の教材化の一環として行った. 材料および方法 １ . 外植体の置床と無菌培養系の確立 材料は２ 種とも2 0 0 1年８ 月に法令による認可に基づいて採取した。 ヒメシャジンは， 南アルプス鳳凰三山・地蔵ケ岳（ 標高2 7 6 4 m 付近） 直下の砂礫地にて， またホウオウシャジンは， 地蔵ケ岳山頂付近の岩隙 にて採取したの植物体の一部から栄養繁殖にて増殖， 育成した個体を用 いた。培養に用いる外植体は茎の葉腋に生じる腋芽とした。腋芽を含む 茎切片を1 0 m m長程度に調整した後， 0 . 1 ％ T w e e n 2 0 を滴下した次亜塩素酸 ナトリウム（ ） 水溶液（ 有効塩素1 . 0 ％ ） に2 0 分間浸漬・攪拌して 表面殺菌した後，クリーンベンチに持ち込み滅菌水で３ 回洗浄を行った。 腋芽の茎頂組織を双眼実体顕微鏡下で0 . 5 程度の大きさに摘出しそれぞ れ培地に置床した。培地は・1 2 )の処方（ 以下， Ｍ Ｓ 処方と いう） を基本として， Ｎ Ａ Ａ （ α - N a p h t h a l e n e a c e t i c a c i d ） とＢ Ａ （ N ６ - b e n z y l a d e n i n e ） をそれぞれ０ ， 0 . 5 および1 . 0 m g / l の各濃度で組み合 わせた計９ 種類の培地を用いた。それぞれ2 0個ずつ供試した。ショ糖は 2 0 g / l とし， ｐ Ｈ 5 . 6 に調整した後， 固化剤としてゲルライトを３ g / l 添 加しオートクレーブで加圧滅菌（ 1 2 1 ℃ ， 2 0 分間， 1 . 2 k g / c m ２ ） した後 冷却した。培養条件はすべて前報2 ） のタカネマンテマの組織培養と同様 とした。置床後3 0 日目に各培地における生育状況（ 平均シュート発生本 数） を比較観察し好適培地を判定した。 ２ . シュート塊の形成と分割増殖 大量増殖を目的として， １ . で得られたシュートを３ 〜 ５ 本程度有す るシュート塊の増殖を試みるため， 引き続き先述の９ 種類の培地に継代 培養した。培養条件も同様とした。それぞれ2 0個ずつ供試した。継代後 3 0日目に各培地におけるシュート塊の形成状況（平均シュート発生本数） を比較観察し， 好適培地を判定した。 ３ . 不定根の誘導・順化と大量増殖系の確立 不定根の誘導を目的として， ２ . で得られたシュート塊（ シュート３ 〜 ５ 本有する組織塊） を１ 個ずつ不定根誘導培地に置床した。供試培地 には， 引き続き先述の９ 種類の培地に継代培養した。培養条件も同様と した。置床後3 0 日目に各培地における不定根の誘導・形成状況を比較観 察し， 好適培地を判定した。 十分に発根した培養個体を培養ビンから出し， 根を損傷しないように 注意しながら流水で固化剤を洗い流し， 湿った用土を詰めたポリポット に植えた。用土は前報1 ） のタカネビランジ・タカネマンテマの栽培で 用いたのものとした。湿度を保つためポリポットごとビニル袋で覆い1 0 日間培養室内に置いた。培養条件も同じにした。その後通常栽培に移行 し生存状況を観察した。 １ . 教材化 前報2 ） と同様に科目「課題研究」（ ２ 単位） におけるヒメシャジンを 材料とした学習指導案を作成し， 実際に授業で外植体の置床と無菌培養 系の確立に係る実験を実施し， さらに前報2 ） と同じ手法で， 第１ 表の到 達度区分に基づいて， 授業結果（ 生徒の習熟程度） について分析と評価 を行った。 結果 １ . 外植体の置床と無菌培養系の確立 ヒメシャジンおよびホウオウシャジンの組織培養による大量増殖系の 確立を試みた。 腋芽置床後3 0日目の各培地における， ２ 種の培養結果を示す。 ヒメシャジンは， Ｍ Ｓ 処方にＢ Ａ 0 . 5 m g / l 添加区で平均シュート発生 本数1 5 . 0 本と最も優れ， 次いでＢ Ａ 1 . 0 m g / l 添加区1 2 . 8 本であった。外 植体からのシュート発生は， Ｂ Ａ 0 . 5 m g 〜 1 . 0 m g / l 添加が優れた。なお， Ｎ Ａ Ａ 単独区ではいずれもシュート発生が認められなかった。Ｂ Ａ ・Ｎ Ａ Ａ 共存区においては， シュート発生が観察されたが， 先のＢ Ａ 単独区 よりは劣った（ 第１ 図）。 ホウオウシャジンは， ヒメシャジンと同様にＭ Ｓ 処方にＢ Ａ 0 . 5 m g / l 添加区が有効であった。しかし， 平均シュート発生本数は6 . 3 本と少な かった。Ｂ Ａ ・Ｎ Ａ Ａ 共存区で， シュート発生が観察されたが本数は非 常に少なかった（ 第２ 図）。 ２ . シュート塊の形成と分割増殖 ヒメシャジンのシュート塊誘導（平均シュート発生本数として）には， 外植体の培養と同様Ｂ Ａ 0 . 5 m g / l 添加区が， 平均シュート発生本数2 5 . 6 本と最も優れた。他の培養成績は， 外植体のそれと同様の傾向が認めら れた（ 第３ 図）。シュート塊は継代培養を繰り返すことで順調に増殖し た（ 第４ 図）。 ホウオウシャジンでは， ヒメシャジンと同様にＭ Ｓ 処方にＢ Ａ 0 . 5 m g / l添加区が最も有効であったが， 平均シュート発生本数が8 . 4本と少なか った（ 第５ 図）。供試培地への反応は， ヒメシャジンと同様の傾向が見 られるが， 培養による増殖はヒメシャジンより緩慢であった。 ３ . 不定根の誘導・順化と大量増殖系の確立 ヒメシャジンでは， 不定根はいずれの試験区でも誘導されたが， 特に 植物ホルモン無添加区が， 平均不定根発生本数1 9 . 9 本と最も優れた。Ｎ Ａ Ａ 単独区およびＢ Ａ ・Ｎ Ａ Ａ 共存区でも不定根の誘導が観察された。 Ｂ Ａ 単独区では著しく劣った（ 第６ 図）。その後の順化・屋外栽培にお いては， タカネビランジと同じ方法1 )で， 問題なかった（ 第７ 図）。以 上によりヒメシャジンの組織培養による大量増殖系を確立した。 ホウオウシャジンでは， やはり， 植物ホルモン無添加区が有効であっ た。平均不定根発生本数1 4 . 7 本であった（ 第８ 図）。他の区の不定根誘 導状況は， 無添加区に比べ著しく劣るか， またはまったく誘導されなか った。順化・屋外栽培は今後のことになるが， この実験の結果， 本種の 再生個体を獲得することができ，植物体再生系は完成できた（第９ 図）。 ４ . 教材化 作成した科目「課題研究」の学習指導案は第２ 表のとおりである。授 業はこの指導案に基づき， 2 0 0 5年９ 月山梨県立農林高等学校システム園 芸科２ 年1 7人を対象に展開した。この授業における学習過程は， まず導 入をはかり（ 実験の意味と方法等説明）， 実験を指導し（ 外植体の持ち 込みと無菌培養系の確立方法）， 最期のまとめを行った。 学習到達度は第３ 表のとおりだった。Ａ 段階は1 7 人中３ 人（ 到達率 ％ ）， Ｂ 段階は９ 人， Ｃ 段階は５ 人であった。到達率は7 0 . 5％ であった。 前報2 ） と同様にＡ 段階の者には学習材料を与え発展的学習を， またＣ 段 階の者には放課後補充的学習として， 外植体の持ち込み方法について個 別に指導した。 考察 南アルプス産ツリガネニンジン属（ A d e n o p h o r a F i s c h e r ） の２ 種につ いて組織培養による大量増殖系の確立を検討し， 教材としての有効性を 探った。 キキョウ科植物の組織培養による増殖研究には， 園芸植物でありかつ 野生個体は絶滅危惧種にリスト1 1 ） されているキキョウPlatycodon grandiflorus において， 腋芽からの培養系1 3 , 1 4 ）， 花蕾子房からの不定芽誘導による 個体再生1 5 ） などの報告がある。ツリガネニンジン属植物の組織培養に よる研究については， これまで報告が見あたらない。 今回著者らが開発したヒメシャジンの腋芽茎頂を外植体とする組織培 養系は， Ｂ Ａ 添加でシュートを誘導・増殖し， 植物ホルモン無添加培地 で不定根を誘導するもので， 簡便でたいへん効率のよい大量増殖方法と 考える。 順化は容易で， 甲府盆地における平地の栽培環境にも十分適応している が， 開花調節が今のところ困難であり現在開花条件を検討しているとこ ろである。ヒメシャジンは草姿や薄紫色に咲く花弁が可憐で美しく， 著 者らが進めているタカネビランジ・タカネマンテマ1 , 2 ） と同様に， 今後 育種的可能性を探っていきたい。 ホウオウシャジンについては， ヒメシャジンと同様の方法で個体再生 に至ったが， 増殖率が振るわず， 順化方法・屋外栽培技術の確立とあわ せて今後の課題としたい。 ところで， 環境庁2000 年版レッドデータブック1 1 )によれば， 同書に はツリガネニンジン属（ A d e n o p h o r a F i s c h e r ） に分類されている種とし て， ツクシイワシャジンA . h a t s u s h i m a e ， ヤチシャジンA . p a l u s t r i s ， ユウバリシャジンA . p e r e s k i a e f o l i a v a r . y a m a d a e , トウシャジンA . s t r i c t a の各種が最上位のカテゴリーである“ 絶滅危惧T Ａ 類（ Ｃ Ｒ ）” にリ ストされている。今回著者らが開発した組織培養系は， これらの同属植 物の保全・増殖方法にも応用できるものと推察される。 なお， 現在ヒメシャジン・ホウオウシャジンの２ 種について， 採種・ 休眠打破法など種子繁殖法の実験を進めている。これが確立されれば， タカネビランジ・タカネマンテマ1 , 2 ） と同様に種子繁殖・組織培養（ 栄 養繁殖） による総合的な増殖技術が完成できるものと考えている。 開発した指導案による授業を実施した。前報2 ） 同様計画的な展開がで きたと考える。授業評価・分析（ 方法は前報2 ） 参照） における授業目標 到達度を判定したところ， 到達率7 0 . 5％ であった。山梨県立農林高等学 校で構築した評価システムは， 各単元の到達度を分析し， その結果を1 6 ） 授業にフィードバックして授業改善に資するのが目的であり， 生徒１ 人 ひとりの観点別の到達度を合計したものを「総合到達度」とし， その通 過（合格）ラインを７ 割，また，当該授業の受講者全員の「総合到達度」 の平均を「平均総合到達度」とし， これが７ 割に満たない場合には授業 内容の検討・改善をすることとしている。この基準からみて， 今回の授 業における到達率7 0 . 5 ％ は許容圏内ではあるが， 前報2 ）（ 7 6 . 5 ％ ） に比 べ低率であった。具体的には， 約3 0 ％ （ 1 7人中５ 人） の者がコンタミネ ーションを生じさせた。原因として， 野外から採取した外植体をN a C l O 水溶液で表面殺菌方法と， それをクリーンベンチに持ち込む際の個々の 操作性の差があらわれたものと考えられた。そこで， Ｃ 段階の５ 人につ いては， その原因を操作の補充を通して十分指導した。 今回用いたツリガネニンジン属植物は， 地域の自然保護を考えさせる 上で好材料であるばかりでなく， 短期間に培養結果が出ることとあわせ て植物組織培養に関する一連のテクニックを習熟させるのに優れた教材 であると思われた。 謝辞 本研究の推進にあたり， 山梨県立農林高等学校教諭清水章男氏には 前報同様， 授業分析・評価方法について御教示・御協力いただいた。本 報のデータの多くは山梨県立農林高等学校（ 平成1 5〜 1 7年度） および山 梨園芸高等学校（ 平成1 8 年度〜 現在） の意欲的な生徒諸君の努力によっ て得られたものである。なお， 研究材料の貴重な植物は， 学術研究を目 的として環境省並びに山梨県の許可を得て採取またはそれをもとに増殖 したものを用いた。以上の方々に厚くお礼申し上げる。 引用文献 １ ） 亀井忠文・吉田智彦（ 2 0 0 8） 山梨県における絶滅危惧植物の保全お よび増殖技術の開発とその教材化（ 第１ 報） 南アルプスにおけるマ ンテマ属絶滅危惧植物の教材化. 日本農業教育学会誌. 3 9 ( 1 ) : 3 3 - 4 2 . ２ ） 亀井忠文・吉田智彦山梨県における絶滅危惧植物の保全および増 殖技術の開発とその教材化（ 第２ 報） タカネビランジの受粉様式の 解およびタカネマンテマの組織培養による大量増殖系確立. 日本農 業教育学会誌.（ 投稿中） ３ ） 北村四郎・村田源・堀勝（ 1 9 5 7 ） ききょう科. 原色日本植物図 鑑（ 上） . p p . 9 0 - 9 6 . 保育社. 大阪. ４ ） 佐竹義輔（ 1 9 8 2 ） キキョウ科. 佐竹義輔ら編日本の野 生植物V . p p . 1 4 9 - 1 5 5 . 平凡社. 東京. ５ ） 豊国秀夫（ 1 9 9 8） キキョウ科. 日本の高山植物. p p . 1 4 0 - 1 4 7 . 山と 渓谷社. 東京. ６ ） 植松春雄（ 1 9 8 1） 山梨県の植物誌. p . 2 9 7 . 井上書店. 東京. ７ ） 山梨県（ 2 0 0 7） 山梨県希少野生動植物の保護に関する条例. ８ ） 大場達之・高橋秀男（ 1 9 9 9 ） 日本アルプス植物図鑑. p 3 7 . 八坂書 房. 東京. ９ ） 植松春雄（ 1 9 5 1 ） フォッサマグナのもつ植物分類学的意義. 植物研 究雑誌. 2 6 : 3 3 - 4 0 . 10） 高橋秀男（ 1 9 7 1 ） フォッサマグナ要素の植物. 神奈川県立博物館研 究報告（ 自然科学） . 第２ 号: 1 - 6 3 ( + P l a t e s ) . 1 1 ） 環境庁編（ 2 0 0 0 ） 我が国における絶滅のおそれのある野生生物− レ ッドデータブック− ８ （ 維管束植物T ） . 1 2 ） （ 1 9 6 2 ） 1 5 : 4 7 3 - 4 9 7 . 1 3 ） H o s o i , T . a n d M . M o c h i d a （ 1 9 9 5 ） M a s s p r o p a g a t i o n o f b a l l o o n f l o w e r （ Platycodon grandiflorus A . D C . ） b y r e p e a t e d s h o o t - s e c t i o n i n g a n d s e p a r a t i o n o f a x i l l a r y s h o o t . E n v i r o n . C o n t r o l . B i o l . 3 3 : 2 1 3 - 2 1 6 . 1 4 ） 米光裕ら（ 1 9 9 8 ） キキョウ（ Platycodon grandiflorum A . D C . ） の組織培 養による増殖. 生薬学雑誌. 5 2 : 3 6 8 - 3 7 1 . 1 5 ） 霞正一ら（ 2 0 0 6） キキョウ花蕾子房からの不定芽形成と植物体再 生. 園学雑. 7 5 : 2 8 4 - 2 8 6 . 1 6 ） 清水章男（ 2 0 0 6 ） 全教科で取り組む目標に準拠した評価システムの 構築と導入. 平成1 5 ･1 6 ･1 7年度学力向上フロンティアハイスクール 推進事業報告書（ 文部科学省・山梨県教育委員会指定） . p p . 9 - 1 5 . 山梨県立農林高等学校.以上