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本頁は“日作紀 日作紀74(2):207-211 (2005.6) に掲載したものです．図表省略
ＲＡＰＤ分析による栃木県水稲優良品種の品種識別
小林俊一・吉田智彦
要旨：栃木県産米の品質向上及び原種，及び原々種の混種防止を目的として，栃木県奨励品種を中心に，品種登録申請中の栃木７号，及び栃木酒14号 (酒造好適米) 等，合計20品種についてのRAPD法による品種識別技術を確立した．これらの品種識別は7種類のランダムプライマーを用いてDNAを増幅した後，1.5％アガロースゲルで電気泳動を行い，エチジウムブロマイド溶液で染色後に現れた９種類のDNAマーカーの多型を比較することで可能であった．
キーワード：水稲，DNAマーカー，栃木県，品種識別，RAPD分析．
Identification of Main Paddy Rice Cultivars in Tochigi Prefecture by RAPD Analysis:Shun-ichi Kobayashi and Tomohiko Yoshida
Abstract:The objective of this study was to establish the technology to identify paddy rice cultivars by the DNA markers of RAPD analyis to raise the quality of rice in Tochigi prefecture and to prevent seed cotamination in the foundation seed and the stock seed. A total of 20 paddy rice cultivars, which included 9 recommended and promising cultivars in Tochigi prefecture, were studied. They could be identified individually by randam amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis using 7 randam primers, following the electrophoresis of the DNA fragments in 1.5％ agarose gels and staining by ethidium bromide.
Key words:DNA marker, Identification of cultivars, Paddy rice, RAPD analysis, Tochigi pref.
栃木県における水稲の生産は，2003年度で作付面積が約65300ha，収穫量は作況指数が92であったが316700tであり本県農業産出額の1/3を占める基幹作物となっている (栃木県農務部 2004)．品種の構成は良食味であるコシヒカリが約8割，次いで県南を中心に縞葉枯病抵抗性の月の光が7％，ひとめぼれ・あさひの夢がそれぞれ約4％となっている．栃木県農業試験場では1987年から水稲品種の育種を開始し，1995年には県南地域向きの縞葉枯病抵抗性で良食味の品種，晴れすがたを育成した (大谷ら 1996)．また，2004年2月に早生で良食味な栃木7号を，10月には酒造好適米の栃木酒14号を品種登録出願した．
一方で，近年消費者の安全性に対する関心や健康志向の高まりにより農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律が改正される (改正JAS法) とともに，農林水産大臣が制定した品質表示基準に従った表示を義務付ける品質表示基準制度が充実・強化された．このことにより，米の流通業者から米品種のDNA鑑定が強く要望されている．さらに，栃木県の種子更新率は2002年産では63％と米の主産県としては低く，この向上も流通業者から求められており，県としては種子更新率100％を目標に掲げている (栃木県農務部 2004)．しかし，これら品種数の増加や種子更新率の向上は原々種や原種生産において作業の煩雑さの増加を伴い混種・取り違えの危険性が高まる．従来、識別は品種の形態や生理特性等で行ってきたが，この方法では気象条件や栽培方法等が結果を大きく左右し，識別が困難となる場合がある。これらの影響を受けないDNAマーカーの利用は品種識別にとって極めて有効である．
イネの品種識別のためのDNAマーカーの開発は大坪ら (1997) がRandam Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 分析を用いて国内作付け上位10品種を識別した．その後，赤木 (2000) はSimple Sequence Repeats (SSR) 分析が近縁品種の識別に有効であるとしている．河野ら (2000) は Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)分析，RAPD分析，SSR分析，Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 分析について日本型品種の多型検出頻度を比較している．多型検出頻度はSSR分析，RFLP分析で高く，これらの組み合わせが連鎖解析手法には有効で，日本型品種識別には検出操作の容易なSSR分析やRAPD分析が有用で特にAFLP分析が適しているとしている．大坪ら (2002) はRAPD分析によって得られた品種識別に好適なバンドをSequence Tagged-Site (STS) 化し，それらのランダムプライマーをマルチプレックス化して使用することにより，日本の代表的な50品種を識別できるプライマーセットを開発した．同様なSTSプライマーを利用して秋田県においても秋田県の奨励品種を識別している (小笠原・高橋 2000)．これらのプライマーセットは極めて有用であるが，栃木県で開発した品種への適用性については検討されていない．
以上の事を踏まえ，DNAマーカーの中で最も検出操作が簡便なRAPD分析を用い，栃木県周辺地域の奨励品種である優良粳品種，及び奨励品種ではないが県の事業等で栽培されていた酒造好適米品種，並びに栃木県農業試験場育成中の有望な系統の識別を試みた．
材料と方法
1．供試品種
供試品種は粳品種では品種登録申請中の栃木７号 (育種家種子5系統) ，栃木県奨励品種のひとめぼれ，晴れすがた，コシヒカリ，アキニシキ，月の光，及びあさひの夢，育成中の有望品種である栃木13号・15号，茨城県の奨励品種であるキヌヒカリ，ゆめひたち，及び日本晴，さらに群馬県の奨励品種であるゴロピカリ，及び朝の光を供試した．酒造好適米では品種登録申請中の栃木酒14号，及び産地品種銘柄の五百万石，ひとごこち，美山錦，及び若水と参考として山田錦を供試した．合計20品種であった (農業技術協会 2003)．ゴロピカリは群馬県産原種を，その他の品種は奨励品種決定調査に供試した種子かあるいは，栃木県農業試験場で維持保存していた種子を用いた．
DNAは葉身からMagExtractor -Plant Genome- DNA抽出キット (東洋紡績株式会社) ，及び同社製自動核酸抽出装置 (MFX-2000) を用いて抽出を行った．
2．RAPD分析による品種識別
鋳型DNA濃度は5ng/μＬとした．PCR反応液はランダムプライマー7.8μＭを0.8μＬ，dNTP混合液2.5ｍＭ (タカラバイオ社) を1μＬ，反応バッファー (タカラバイオ社) を1.25μＬおよびrTaq (タカラバイオ社) 0.5 unitに滅菌蒸留水を加え12μＬとした．PCRは，サーマルサイクラーDNA Engine Tetrad PTC-225 (MJ Japan社) を用い，熱変性を94℃で3分後，94℃で1分間，アニーリングを44℃で1分間，72℃で2分間を1サイクルとして40サイクル行い，伸長反応を72℃で2分間行った．増幅したDNAは1.5％アガロースゲルを用い100Ｖの電圧で約90分間の電気泳動を行った．電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液で30分間染色後，デンシトグラフ (アトー社) を用いDNA増幅産物を確認し，PCR増幅バンドの有無によるDNA多型を検出して品種識別を行った．
品種識別のためのプライマーは，大坪ら (1997)，吉橋ら (1999) 及び森ら (2001) 等を参考に多型の見られた23プライマーを選定した．20プライマーは10量体 (オペロン社)，3プライマーは12量体 (和光純薬社) である．
結果
供試した23プライマーの内，22プライマーで増幅がみられ，合計178バンドが検出できた．これらのバンドの内，DNA多型が認められたのは13プライマーで25バンドあった．DNA多型が認められたランダムプライマーについては，最低2回DNA多型を再確認した．その結果，明瞭かつ再現性の高い多型をDNAマーカーとした．得られたDNAマーカーは12プライマーにおいて17種類に絞られた (第1表)．これらのDNAマーカーにおいて栃木7号の系統間ではすべて多型は見られなかった．178マーカーで多型が見られなかったことから，かなりの確率で固定していると推察された．そこで，栃木７号に関しては系統毎ではなく，栃木7号として表した．
これらの17種類のDNAマーカーの内，プライマーOPD2を用いて増幅した800bpのDNAマーカーとA09で増幅した1600bpのDNAマーカーで得られた多型は同じであった．プライマーA03の810bpで得られた多型は美山錦にのみ出るポジティブな品種特異的マーカーであった．また，OPM2の1000bpで得られた多型は栃木15号のみにDNAマーカーが現れないネガティブな特異的マーカーであった．さらに，OPB1，OPB18，OPC9，OPD2，OPD3，OPG6，OPS13の7種類のランダムプライマーで増幅された9マーカーを用いることによって，供試した20品種すべてを識別することができた (第1図)．第1表に○印を付けて示したのがこれらのプライマー及びDNAマーカーの長さである．また，7プライマーの塩基配列を第2表に示した．
考察
本実験ではアニーリングの温度を44℃で行った．従来，アニーリングは36〜40℃で行われている例が多いが，予備的に35℃から46℃までの温度で検討した．その結果，35.0℃では1000bp以上にミスマッチと思われる薄いバンドが幾つか見られた．これらのバンドは温度が高くなるに連れて薄くなり，39.7℃でほとんど見えなくなった．逆に41.6℃から900bp付近と1200bp付近に明瞭なバンドが現れ，温度が高くなるに連れ濃くなり，44.3℃から安定した(データ略）．また，鋳型DNAの濃度を50〜5ng/μＬに変えた場合，濃度が薄くなるにつれてバンド数は増加し，パターンは明瞭となった (データ略）．以上のことから，鋳型DNA濃度は5ng/μＬとし，PCRは熱変性を94℃で3分後，94℃で1分間，アニーリングを44℃で1分間，72℃を2分間で1サイクルとして40サイクル行い，伸長反応を72℃で2分間行う条件で実施した．
本研究では，RAPD分析のみを用いて栃木県水稲優良品種を識別できるマーカーの組み合わせを見出した．イネ品種の識別法としては，RAPD分析の他にRFLP分析，SSR分析及びAFLP分析等が実施されている．将来的に採種担当者および農業協同組合関係者等の現場での利用を前提として考えた場合，操作方法の簡易性及び安全性を考慮する必要がある．RFLP分析は操作が煩雑であり，この目的にそぐわない．一方，SSR分析やAFLP分析はDNAマーカーの長さが短い場合が多く，電気泳動の際，アガロースゲルよりもポリアクリルアミドゲルが適している．しかし，ポリアクリルアミドゲルの材料となるアクリルアミドは毒性が強く，使用する際には熟練を要する．また，アガロースゲルを使用する場合には，アガロース濃度を高める必要がある．1.5％程度のアガロースゲルは作製も容易で染色する際のハンドリングも良く安全である．この濃度で検出しやすいDNAマーカーの長さは400bpから2400bpまでである．そこで，本研究ではこれらの長さのDNAマーカーを検出するのに最も適していると考えられるRAPD分析を採用した．
RAPD分析を用いたイネの品種識別法は，大坪ら (1997) や小笠原･高橋 (2000) によって確立されている．しかし，栃木県育成品種については知見が無い．そこで，筆者らは栃木県内で生産されている，または生産される可能性の高い品種についてRAPD分析を適用した．大坪ら (1997) は当初，10品種を識別するために600プライマーを検討した．それに対し筆者らはわずか23プライマーで19品種を識別できるランダムプライマーを選定できた．これは，これまでの品種識別に関する文献を参考に多型の出る可能性が高いランダムプライマーを使用したためである．今後も新しい品種が出てくる毎にこれまでの情報を有効に利用することが必要である．本報告では再現性が高く，かつ，明瞭なバンドをDNAマーカーとして選抜した．しかし，RAPDマーカーは一般的に他のDNAマーカーに比較して再現性が低いと言われている．また，不要なバンドが出て視認性が劣る．今後は大坪ら (2002) や小笠原･高橋 (2000) のようにSTS化し，さらに，マルチプレックス化することによって操作回数を減らし簡便化すること，また，視認性を高める必要がある．
本報告では前述のような理由でRAPD分析のみで識別を行った．しかし，今後はより近縁度の高い品種が多数開発される可能性が高く，さらに効率的に多型を検出することが必要である．そのためには，RAPD分析だけではなく，AFLP分析，SSR分析等も実施する必要性が考えられる．また，イネで使用している例は少ないが，イチゴ (Kunihisaら 2003) や大麦 (内村ら 2004) の品種識別に利用されているCleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 分析や品種識別を目的とはしていないが大麦 (Fernandezら 2002) やイチゴ (Cekicら 2001) で用いられているInter-Simple Sequence Repeat (ISSR) 分析も有効な手法と思われる．
本研究ではDNAをMagExtractor -Plant Genome- DNA抽出キットを用いて葉身から抽出した．実際には，種子生産や米の流通関係者が識別業務を行うことが予想され，穀粒から抽出したDNAを使用することになると考えられる．吉田ら (注：平成10年度兵庫県成果情報) は酒米5品種で，RAPD分析による品種識別法を開発した．その中で生葉，及び米粒から抽出したDNAにおいて検出された多型バンドは同一であることを確認しており，本研究で得られた品種識別法についても，穀粒から抽出したDNAを用いることは可能と考えられる．
今後、実用性を高めるには穀粒から抽出する簡便な方法が必要とされよう．一般にはCTAB法 (Murrayら 1980) ，及びその改変法や市販されているDNA抽出キットが使用されているが，CTAB法は操作手順が多く時間がかかる．また，DNA抽出キットは高額である．葉身については非常に簡便なDNA抽出法 (池田ら 2000) が確立されている．本研究で確立した品種識別法を現場に適用するまでにはさらに簡易で安価な穀粒からのDNA抽出方法を確立する必要があると考えられた．染色についても，エチジウムブロマイドよりも安全性の高い蛍光色素が市販されていることから，それらの利用についても組み合わせて検討していく必要があると考えられた．
謝辞：本研究の遂行に当たり，材料の提供を頂いた群馬県農業技術センター生産技術部、ご助言を頂いた (独) 食品総合研究所大坪研一博士に感謝します．
引用文献
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第1図 供試した20品種を識別できる７種類のランダムプライマーで検出されるDNA.
図の下にランダムプライマー名を示す．図はいずれも左のレーン1番目から，1.サイズマ ーカー (200bp DNA ladder) ，
2.栃木7号-1，3.栃木7号-2，4.栃木7号-3，5.栃木7号-4， 6.栃木7号-5，7.ひとめぼれ，8.晴れすがた，9.コシヒカリ，
10.アキニシキ，11.月の光， 12.あさひの夢，13.栃木13号，14.栃木15号，15.キヌヒカリ，16.ゆめひたち，17.日本晴，
18.ゴロピカリ，19.朝の光，20.栃木酒14号，21.五百万石，22.ひとごこち，23.美山錦， 24.山田錦，25.若水．
矢印が識別マーカー.
第1表 RAPD分析による品種識別.
DNA多型の現れたマーカーの品種毎の有無を０ (バンド無し)，１ (バンド有り)で示した．
○印は20品種を識別できるマーカーのセットを示している．
第2表 ランダムプライマーの塩基配列.
以上