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本頁は“日作紀69(2):224-228,2000”に掲載したものです．図表一部省略．
トウジンビエの葯培養方法および再分化植物の染色体数
重宗明子・吉田智彦＊
(九州大学)
2000年2月14日受理．＊連絡責任者 (〒812−8581福岡市九大農学部)．本研究の一部は科学研究費によった．
要旨：トウジンビエの葯培養の効率化を探るため，5種類の培地，品種，生育ステージ，および低温処理について検討した．さらに葯培養によって得られた植物の染色体数について調査した．葯は長さ0.5〜1.0mmの四分子期前後の花粉を含むものが適し，10℃，7〜9日の低温処理が有効であった．MS培地に2.5mg/Lの2,4-Dを加えた培地では，置床葯あたり全カルスの誘導率は約10％となり，さらに植物体再分化率は0.16％であった．すべての培地を合わせて15個体の葯培養起原の植物が得られた．品種間差は明確でなかった．それらの植物のほとんどに自然倍加が起こっていたが，すべて部分的にしか倍加が起こらない混数体で，稔性も低く，培養法の改良や培養反応の高い材料の選抜が必要と考えられた．
キーワード：混数体，再分化率，トウジンビエ，不稔，葯培養．
Methods of Anther Culture of Pearl Millet and Ploidy Level of Regenerated Plants：Akiko Shigemune and Tomohiko Yoshida* (Fac. of Agr., Kyushu Univ., Fukuoka 812−8581, Japan)
Abstract：To improve the regeneration efficiency from anther culture of pearl millet (Pennisetum typhoideum Rich.), we studied the influence of the composition of culture media, stage of anther and low temperature treatment on the anther culture. The anthers having pollen around the tetrad stage were most suitable for anther culture and low−temperature treatment (10℃, 7〜9 days) was effective for the callus induction. On the MS medium supplemented with 2.5mg/L 2,4-D, the callus induction rate was about 10% and the plant regeneration rate was 0.16%. No varietal difference was observed. Fifteen plants were regenerated in total, but all of them were mixoploid and the fertility was very low. More studies are needed to find better culturing methods, and to select the genotypes suitable for anther culture.
Keywords: Anther culture, Mixoploid, Pearl millet, Regeneration rate, Sterility.
トウジンビエ (Pennisetum typhoideum Rich. 2n=2x=14) は高温，乾燥など，過酷な環境下でも生育できる，世界の半乾燥熱帯における非常に重要な他殖性の作物である (Kumar and Andrews 1993，Burton and Powell 1968，ICRISAT 1996)．放任受粉品種の他にも，ハイブリッド品種の育種が盛んで，アメリカでの飼料栽培はもちろん，インドで栽培されている品種の40％はハイブリッド品種である (Jauhar and Hanna 1998)．通常は自殖を6〜7回繰り返して，ハイブリッドの親となる近交系が作出されている．イネ，コムギなど自殖性の作物においては葯培養による育種年限の短縮が広く行なわれているが，他殖性のトウモロコシにおいても，葯培養により倍加半数体を作り，それらの組み合わせ能力を検定した報告がある (Wu 1986)．またコムギの雄性不稔維持系統候補の育成のために葯培養を利用した報告もある (Shimada ら1994)．したがって葯培養はトウジンビエのハイブリッド育種においても，育種年限の短縮のための手段であると期待される．
しかし現在，トウジンビエの葯培養に関する研究は少なく，また再分化率も非常に低いと報告されている (Choiら 1997)．また，葯培養では一般的にカルスを経ることによって遺伝的変異や多染色体性を示すことが多い (新関 1979)．したがって本研究では，まずその再分化率を向上させるため，培地や材料，前処理について検討した．また，葯培養起原の植物の染色体を観察し，倍数性についても調査した．
材料と方法
1. 葯培養
実験は予備実験を1998年7月から10月に，本実験を1999年3月から8月にかけて行った．品種はICRISATから導入した短稈・早生の集団であるICMV89074を九州大学構内の圃場で一穂粒重の大きいものについて選抜した集団 (短稈集団) (Totokら 1998) と，九州大学保存の数種の早生の育種材料からなる長稈集団の2品種を用いた．それらを九州大学構内の温室でポット栽培し，出穂前の穂を採取して培養に供した．培養の前に，花粉 (小胞子) の発育時期の目安として葉耳間長，穂の長さ，葯の長さを測定した．さらに，葯から取り出した花粉を酢酸カーミンで染色し，葯の大きさと花粉の発育時期の関係を調べた．
次に前処理として，10℃の低温処理を0〜14日間行い，低温処理程度として0日間をI，1〜3日間をII，4〜6日間をIII，7〜9日間をIV，10〜14日間をVとした．また，脱分化培地は第1表に示すように，D1:ソルガムの葯培養（Canら 1998），D2，D4，D5:トウジンビエの花序培養（Botti and Vasil 1984, Naborsら 1983, Talwar and Rashid 1990），D3:トウジンビエの小胞子培養（Ha and Pernes 1982）の各報告を参考にして基本培地および植物成長調節物質組成を決定した．すべてスクロースは20g/L加え，ゲル化剤としてgellan gumを1.5g/L加えた（Canら 1998）．
培地をオートクレーブ後，90×15mmのプラスチック製の滅菌シャーレに25mL入れ，1シャーレに30個の葯を置床し， 30℃暗黒条件のインキュベーターに入れた．約1週間後からカルス化し始め，直径2mm程度になったものをカルスとみなし，全カルス数を記録した．記録は置床後約1か月間続けた．カルスの大きさが直径5mm程度になったものを再分化培地に移植した．Vasil (1987) は，イネ科植物の培養においてはEmbryogenic callus (Eカルス) を選抜し，継代培養することが必要であるとしている．今回の実験でもEカルスを選抜してその数を数えて移植した．Non−Embryogenicカルス (NEカルス) が半透明でもろいのに対して，Eカルスは白く細かい細胞からできており，表面が滑らかで硬い性質をもっているので，それらを肉眼で判別した (第1図)．Talwer and Rashid (1990) はトウジンビエの花序培養において，NEカルスは再分化培地に移しても根を生じるのみで，胚発生を行わないと報告している．
再分化培地はMS培地にIAA 3.0mg/L，kinetin 2.5mg/Lを加え，スクロースおよびgellan gum濃度は脱分化培地と同様としたものを用いた（Canら 1998）．それを60×90mmのコニカルビーカーに入れ，1ビーカーにつき2つのカルスを移植した．カルス置床後は25℃，光条件400μmol m−2 s−1の人工気象室に入れた．約2か月後，再分化個体をバーミキュライトを入れたペーパーポットに移植し，根がよく伸びるまで人工気象室で栽培し，その後ポットに移植して温室に移した．出穂後に袋をかけて自殖させ，採種した．
2. 再分化植物の染色体数
ポットに移植前の幼植物 (再分化培地に移植して2か月程度) と，葯培養起原の植物から得られた種子由来の根端を，酵素解離ギムザ染色法によって染色体観察した．根端を0.05％コルヒチン溶液で1時間前処理し，固定液で1時間固定した後，水洗し，4％セルラーゼと2％ペクトリアーゼを混合した酵素液を加えて，1時間，34℃で酵素解離させた．その後再固定し，ピンセットで根端組織をおし潰して展開し，乾燥後5％ギムザ液で1時間染色した (日向 1990，Can and Yoshida 1997)．染色体数のはっきり分かる細胞について，染色体数を数えた．幼植物6個体合計123細胞，種子由来の根端の合計30細胞について観察した．
なお，1998年の予備実験では短稈集団を用い，培地もD1のみとした．この予備実験により得られた個体から採種して染色体を観察した．以後，データとして処理したのは1999年の本実験の結果である．予備実験，本実験を合わせて，約14000個の葯を置床した．培地別，集団別に，1週間の間に置床した総シャーレを1反復として統計処理した．
結果と考察
1. 葯培養
短稈，長稈集団を合わせたD2，D3培地における全カルス誘導率 (全カルス誘導数/置床葯数) と葯の長さの関係を第2図に示した．葯の長さが短いほうがカルス誘導率は高い傾向がみられた．一般的に葯培養には四分子期から第1有糸分裂期直後の花粉が適しているといわれている (新関 1979)．今回トウジンビエの花粉 (小胞子) を観察したところ，花粉の正確な発育段階は判定できなかったが，長さ0.5mmの葯は，四分子期以前であると推察される．また1.0mmに達した葯ではすでに一核期の小胞子となっていた．今回の実験でも，小花から葯を摘出できる最小の長さ0.5mmから1.0mmの葯が適しており，四分子期前後の花粉を含む若い葯を使うことが重要であることが示された．一方，葉耳間長や穂の長さは短いほうが全カルス誘導率は高い傾向がみられたが (データ略)，一つの穂の中でも上下で葯の長さは異なるので，補助的な指標として用いるのが適切と考えられる．
第3図に低温処理程度とEカルス誘導率 (Eカルス誘導数/全置床葯数) の関係を示した．培地によって低温処理の及ぼす影響は異なったが，特にD3培地においては低温処理程度IV，つまり7日〜9日間でEカルス誘導率が高くなった．したがって，トウジンビエにおいても低温処理が有効であることが示された．なお，Choiら（1997） は，9℃，14日間の低温処理が胚様体誘導および緑色植物体再分化に効果的であったと報告している．また，今回の実験では植物体の再分化はEカルスのみから起こり，NEカルスからは根を生じたのみであったことから，葯培養においてEカルスを誘導することの重要性が確認された．
第1表に培地別，短稈，長稈集団別の全カルス誘導率とEカルス誘導率 (Eカルス誘導数/置床葯数)，および再分化植物体数を示した．すべての培地からカルスが得られたが，全カルス，Eカルスの誘導率および再分化植物体数は培地によって大きく異なり，他の培地に比べて植物成長調節物質が少ないD2，D3培地がすべてにおいて優れていた．植物成長調節物質が少ないほうが葯壁など半数体以外からの再分化を阻害できるという水稲についての報告がある（新関 1979）．今回の実験では，カルスは花粉から分化していることを観察しており，得られた再分化個体は半数体起原であると思われる．合計 15個体の再分化植物が得られたが，再分化率 (再分化植物体数/置床葯数) は，D2培地で0.16％，D3培地で0.19％となり，イネでの再分化率が品種間差はあれ，5％程度であるのに比べると (島田ら 1999)，非常に低い値となった．
集団間の差については，第1表のように長稈集団の方が全カルス，Eカルス誘導率共に高い傾向がみられたが，反復間のばらつきが大きく，有意な差は検出できなかった．今回用いた材料は放任受粉品種であり，遺伝的にも雑多な集団であるため，このような結果となったと考えられる．さらに前述のように，再分化率も実際の育種に利用するには非常に低いので，今後はさらに培養方法を検討しなければならない．また，葯培養による再分化率は，優性効果によるものであると報告されており (Wan and Widholm 1993，Can and Yoshida 1999)，交配と選抜によって再分化率を高めることが可能だと考えられる．したがって，再分化率の高い品種とされるICRISAT育成の843Bと7042DMRの2品種 (ICRISATのDr. Shyamalaの私信による) を用いるなどして，ある程度我が国での栽培用に改良した早生・多収集団の再分化率向上を図っていきたい．
2. 再分化植物の染色体数
第2表に示したように，観察した個体はすべて混数体であった．トウジンビエは自然倍加が頻繁に起こると報告されているが（Powellら 1975），今回の結果では幼植物体でも根端細胞に2倍性の染色体数のものが多く認められ，再分化個体を誘導し培養する過程の中で，既に自然倍加が起こっていることが示唆される (第2表，第4図)．なお，倍数性細胞の他に，異数性の細胞も数多く観察された．
今回はコルヒチンなどによる染色体の倍加処理は行っていないが，Wan and Widholm (1993) によると，トウモロコシの再分化個体に倍加処理を行うと，細胞分裂が同時でないため倍加半数体の部分を含んだキメラが生じ，自殖させても種子はほとんど得られないとしている．一方，半数体のカルスに倍加が起こると，それから再分化した植物の大部分はキメラでない倍加半数体となる．また，彼らは3年間にわたってトウモロコシの葯培養起原のカルスの倍数性を調べたところ，20系統が半数体で，6系統が2倍体であったが，カルス誘導後2〜4か月後の細胞は，混数体ではなく，半数体か2倍体のいずれかであった．これらの結果から，倍数性レベルは非常に安定で，染色体の自然倍加は，カルス誘導前に起こるとしている．
今回得られた植物体は混数体で，稔実の程度も低かった．第2表のように，染色体数が一定であるほど稔実の程度は高い傾向がみられた．稔実の程度が低い個体では，部分的にしか染色体倍加が起こっていないため，配偶子も正常でなく，そのため大部分が不稔となったと考えられる．すべての葯が裂開しない完全に不稔の個体もあった．また，種子も混数体であり，その稔性が懸念される．今後さらに再分化植物体数を増やし，稔性について検討し正常な倍加個体を効率良く得る方法や，効果的な染色体の倍加方法についての研究が必要である．
また，葯培養によって得られた系統の稔性とともに，生育についても調査を行っていく必要がある．イネにおいて葯培養法と通常の育種法と比較した大里ら (1999) は，葯培養育種法では収量などが劣る傾向があり，再分化系統を増やして育種規模を大きくする必要があるとしている．コムギでは，Winzelerら（1987），Baenzigerら (1989) やMitchellら (1992) が葯培養法と交雑育種法で得られた系統の比較を行っている．トウジンビエでは，Ha and Pernes (1982) が葯培養で再分化した2個体を自殖させて採種した2系統を播種し，1か月後の草高，葉の大きさ，葉数について原品種と比較したところ，葯培養起原の系統は，草高が低く，また葉も小さくなった．また，それらの2系統は完全に不稔であったと報告している．
今後はさらに今回得られた系統の組合せ能力も検討し，トウジンビエのハイブリッド育種のための葯培養による近交系作成の可能性を探っていきたい．
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第1表 培地別，集団別の全カルス，Eカルス誘導率および再分化植物体数．
同一の大文字アルファベット間には，培地の間に5％水準で有意差がないこと，
同一の小文字アルファベット間には，集団の間に5％水準で有意差がないことを
示す (ダンカンの多重検定による)．
第2表 幼植物および種子由来の根端細胞の染色体数．
表中の数字は細胞数，( ) は観察細胞数に対する割合の％を示す．稔実程度は，
○:良，△:不良，×:完全不稔を表す．
第1図 Eカルス (左下) とNEカルス (右上)．
第2図 葯の長さと全カルス誘導率の関係．D2，D3培地は第1表の培地を参照．
＊＊は相関係数が1％水準で有意であることを示す．
第3図 低温処理とEカルス誘導率の関係．低温処理は10℃で，I:0，II:1〜3，III:4
〜6，IV:7〜9，V:10〜14日間行った．D2，D3培地は第1表の培地を参照．
グラフ上の数値は全置床葯数を示す．
第4図 再分化培地に移植して約2か月の幼植物の根端細胞の染色体．左が半数
性 (n=7)，右が2倍性 (2n=14) の細胞である．
以上