吉田｜国内二条大麦のDNAマーカーによる品種識別

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日作紀73(2004)に掲載

国内二条大麦のDNAマーカーによる品種識別

内村要介1,2)・古庄雅彦1)・吉田智彦3)
(1)福岡県農業総合試験場・2)東京農工大学・3)宇都宮大学)
要旨：二条大麦の種子の純度維持，品種育成者の権利保護および農作物の品種の適正な取引の検査を目的として，DNAマーカーによる二条大麦品種の識別技術を確立した．識別が可能な二条大麦品種は，近年国内で栽培されている22品種，および外国2品種の合計24品種である．これらの品種識別は，9種類の STSプライマーと6種類の制限酵素の組合せによる9通りのPCR反応と制限酵素処理を行ったDNA断片について，1.8%アガロースゲルを用いた電気泳動で分画することで可能であった．さらに，同様の24品種間において1.8%アガロースゲルを用いた電気泳動で多型検出が可能で，視認性かつ再現性に優れているCAPSマーカー28種類，SSRマーカー1種類，RAPDマーカー5種類も選定した．
キーワード：SSR分析，CAPS分析，DNAマーカー，二条大麦，品種識別，RAPD分析．

Identification of Japanese Two-rowed Barley Cultivars by DNA Markers: Yosuke UCHIMURA*,1,2), Masahiko FURUSHO1) and Tomohiko YOSHIDA3)(1)Fukuoka Agr. Res. Cent., Chikushino, Fukuoka 818-8549, Japan; 2)Tokyo Univ. of Agr. and Tech.; 3)Utsunomiya Univ.)
Abstract: The objective of this study was to establish the technology to identify barley cultivars by the DNA markers for the purpose of managing the foundation seeds and for protecting the breeder's right and the brand seeds from pirated cultivars. A total of 24 two-rowed barley cultivars, which consisted of 22 Japanese cultivars and 2 foreign cultivars, were identified individually by cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) analysis of the DNA polymorphism using 9 sequence tagged site (STS) primers and 6 kinds of endonucleases, following the electrophoresis of the DNA fragments in 1.8% agarose gels. In addition, we selected 28 CAPS markers, 1 simple sequence repeats (SSR) marker and 5 randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers that could clearly and reliably detect DNA polymorphism among 24 cultivars.
Keywords: Barley, CAPS, DNA marker, Identification of cultivars, RAPD, SSR.

　農作物の品種とは，育成者の多大な努力によって，形態，生理作用および栄養成分など農業上重要な形質が改良された，他の集団と区別できる集団である．そのため，異品種の混入は，生産段階では生産性が不安定となり，流通段階では品質が変わるため，生産者のみならず実需者や消費者にとって好ましくない．一方で，品種は育成されて一度世に出回ると増殖が比較的容易である．そのため，市場価値の高い品種は育成者の許諾なしに栽培，増殖されたり，一方で，市場価値の低い品種で偽った取引に利用されるおそれがある．近年，農産物の一連の偽装表示事件を受け，農林物資の規格化および品質表示の適正化に関する法律である改正JAS法や，農作物の品種の育成者権の保護を目的とした種苗法の一部改正法が制定された．このような農産物を取り巻く現状からみて，品種の育成者の権利保護，農作物の品種の適正な取引による品質の高位安定化のため，また，消費者の食品の情報公開への関心の高まりからみて，品種を識別する技術の確立が強く求められている．

　イネやムギ類などの主要な作物においては，優良種子の生産や普及を促進するための主要農作物種子法により，都道府県の農業試験場が原々種や原種種子の生産を行っている．原々種や原種圃では，品種の純度維持のため，栽培によって品種特有の出穂期，成熟期および草型など形態的特徴を植物体ごとに検査して，異品種や変異体の除去を行う．しかし，生産年や栽培環境により個体間差が認められる農作物について，品種を簡易かつ迅速に判別できる決定的な判断材料はあまりない．

　二条大麦では，用途がビールや焼酎などの醸造用と味噌などの食糧用があり，それぞれの用途に適した品種が育成されている．これらの国内で育成された品種についての精度の高い識別技術の確立は，品種の純度を維持し，品種特有の品質の高位安定化を図るため，また，用途に合う品種や需要の高い品種の確実な供給のために，急務となっている．

　近年，わずかな量のDNAからプライマーで挟まれた特定領域のDNA断片を短時間に大量に増幅するPCR (Polymerase Chain Reaction) 法が開発され，品種間の微細なDNA構造の違いであってもDNA多型として容易に検出することが可能となった (赤木 2000)．DNA構造の品種間の違いを検出する技術が優れている点としては，少量の試料で精度の高い品種識別が可能であり，検査できる対象物や時期が，異なる産地や生産年次の品種の識別 (大坪ら 1999a)，長期間貯蔵している種子 (Matsueら 2002)，精米1粒の分析によるブレンド商品の品種の特定 (赤木 2000) や加工食品である炊飯米 (大坪ら 1999b) 等，広いことが挙げられる．

　実際，米においては秋田県総合食品研究所で開発したDNA鑑定法 (小笠原・高橋 2000) の実用化により，JA秋田が品種鑑定シールを貼って出荷している (赤木 2000)．

DNAマーカーを利用した品種識別技術の開発において，まず，DNAマーカーの開発または選定では，水稲では遺伝的背景が近縁な日本型品種間のDNA多型検出頻度は著しく低く (久保ら 2000，河野ら2000)，選定には多大な時間，労力が必要であり (久保ら 2000)，大きな初期投資が求められる (赤木 2000)．河野ら (2000) は遺伝背景が近縁な日本型水稲品種間において効率的にDNA多型を検出する方法をAFLP，RFLP，SSRおよびRAPD分析から比較検討し，その結果，日本型水稲品種間の品種識別には，DNA多型検出頻度と検出操作の容易さからはSSRとRAPD分析が有用であり，特に多数のDNA増幅断片を一度に検出できることからみるとAFLP分析が適していると報告している．一方，PCRによる品種識別の最も重要なポイントとして，再現性 (赤木 2000) が求められる．

　二条大麦では，効率的にDNA多型を検出する方法や検出頻度について，遺伝的背景が近縁な国内品種間で比較検討した報告はないようである．一方，再現性についてみると，筆者ら (内村ら 2000) がRAPD分析により国内二条大麦8品種を識別可能なRAPDマーカー5種類を得たが，PCR反応を行う機種の違いによってはこれらのRAPDマーカーの再現性が失われることがある．

　そこで，近年国内で栽培されている二条大麦品種22品種と外国二条大麦2品種の計24品種を供試して，視認性，再現性が良好で効率的に品種識別できる多型を検出できる方法について，SSR，RAPDおよびCAPS分析から比較検討を行った．また，供試した24品種すべてを識別できる，視認性と再現性が優れ，最も効率的かつ最小のDNAマーカーの組合せを明らかにしようとした．

材料と方法
1．供試品種
　供試品種は，近年，国内で栽培されている二条大麦 (日本麦類研究会 2002) 22品種，あまぎ二条，アサカゴールド，ミハルゴールド，ほうしゅん，九州二条16号，ニシノゴールド，ダイセンゴールド，きぬゆたか，ミサトゴールデン，スカイゴールデン，なす二条，おうみゆたか，とね二条，みょうぎ二条，はるな二条，きぬか二条，ミカモゴールデン，さきたま二条，タカホゴールデン，ニューゴールデン，ニシノチカラおよびニシノホシと，DNA多型検出頻度の比較のために加えた外国二条大麦2品種，Harrington，Pallasの合計24品種である．これらはすべて福岡県農業総合試験場で維持，保存していたものである．DNAの抽出はプラスチックポットに栽培した幼植物の生葉からCTAB法 (Murray and Thompson 1980) により行った．

2．CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)解析
　プライマーはBlakeら (1996) とManoら (1999) が作成したなかから，Kaiら (2003) が国内二条大麦品種きぬゆたかと吉系15との間のDNA多型解析を行った結果の情報を利用して，比較的明瞭なDNA断片を得たプライマーから優先的に使用した．PCR反応液は，全DNA20ng，Forward側プライマー10pMとReverse側プライマー10pM，dNTP混合液2.5mM，塩化マグネシウム25mM (タカラバイオ社製)，反応バッファー (タカラバイオ社製) およびEX Taq 0.05unit (タカラバイオ社製) および滅菌蒸留水を合わせて10μLとした．PCR反応は，Program Temp Control System PC-808 (ASTEC社製) で95℃を5分後，熱変性を94℃で1分間，アニーリングを55℃で1分間，伸長反応を72℃で2分間を1サイクルとして35サイクル行い，反応停止を72℃で5分間行った．PCRで増幅したDNA断片は，16種類の制限酵素HinfI，EcoRI，EcoRV，EcoT14I，PstI，DraI，EcoO65I，EcoT22I，BanII，HaeIII，MboI，BspT107I，FokI，Csp6I，Hin6Iおよびcfr13Iを1unitと緩衝液を加えて一昼夜の消化処理と，無処理の計17種類の処理を行った．制限酵素断片の分画は0.5×TBE 緩衝液中にて1.8%のアガロースゲルで200Vの電圧により55分間の電気泳動を行った．電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液で染色後，紫外線照射下で，制限酵素断片長多型を観察して品種識別を行った．

3．RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)解析
　プライマーは，筆者らが選定した5種類 (内村ら 2000) と，STAFF研究所から分譲して頂いた48種類合計53種類を用いた．再現性の確認のため，同一品種の異なる植物体からDNAを抽出し，同一条件で再度PCR反応を行った．PCR反応液は，全DNA20ng，プライマー20pM，dNTP混合液2.5mM，塩化マグネシウム25mM (タカラバイオ社製)，反応バッファー (タカラバイオ社製) およびEX Taq 0.05unit (タカラバイオ社製) および滅菌蒸留水を合わせて10μLとした．PCR反応は，前述のPC-808 (ASTEC社製) で95℃を5分後，熱変性を94℃で1分間，アニーリングを36℃で2分間，伸長反応を72℃で3分間を1サイクルとして40サイクル行い，反応停止を72℃で5分間行った．PCR増幅産物の分画と検出はCAPS分析と同様に行い，PCR増幅産物の有無による多型を観察して品種識別を行った．

4．SSR(Simple Sequence Repeats)解析
　PCR反応液の組成，PCR反応の機種およびPCR反応条件はCAPS分析と同様の方法で行った．プライマーの組合せは，Ramsayら (2000) が公表している組合せのうち，Kaiら (2003) が国内二条大麦品種きぬゆたかと吉系15との間でDNA解析を行った結果の情報を利用して，比較的明瞭なPCR増幅産物を得たプライマーの組合せを優先して50種類とした．PCR増幅産物の分画については3.0％アガロースゲルを用いて，200Vで約60分間行った．

結果
1．分析方法の違いによるDNA多型検出の比較
　第1表にRAPD，SSR およびCAPSの分析多型検出方法別の多型検出数およびその頻度を示した．多型検出頻度は，2品種の組合せの間で，調査したプライマーに対する多型を検出したプライマーの数の頻度を示す．多型検出頻度の平均は，国内品種では供試した22品種間の231組合せの多型検出頻度の平均値を示す．国内品種と外国品種との間の多型検出頻度の平均値は国内22品種と外国2品種の44組合せの平均値を示す．

その結果，RAPD，SSR およびCAPSの分析方法において，多型検出頻度の平均値は，国内品種間では1.5％，0.3％，4.0％であり，外国品種と国内品種間での2.5％，0.8％，8.2％に比べて低かった．国内品種間において，多型を検出できなかった品種の組合せがRAPD，SSRおよびCAPS分析に，それぞれ56組，174組および9組認められた．この時点で，多型検出数および検出頻度からみて最も効率的に多型を検出した分析方法はCAPSであった．また，CAPSはRAPDやSSR分析に比べて，PCR反応によるDNA断片の増幅，DNA多型の再現性および多型の視認性が良好であった．

2．CAPS分析
　CAPS分析により多型を検出できなかった国内品種9組について，さらに新たなプライマーを30種類用いて分析したところ，多型を検出できなかった国内品種 9組においても多型を検出することができた．

第2表に品種間で得られたDNA断片の電気泳動によるバンドパターンの違いを，0，1，2，3，4の数字で区別して示した．同一のSTSプライマーと制限酵素の組み合わせにおいて，数字が異なる品種間は多型が検出され識別が可能であることを示す．見えにくいバンドや識別が困難なバンド間の差は無視した(第2表，第1図)．本実験で多型を検出したプライマーと制限酵素は37組合せあった．そのうち，ABG004，ABG462，aMST102およびcMWG728の4種類は制限酵素処理をしなくてもPCR増幅産物による多型が検出でき，そのままSTSマーカーとして利用が可能であった．また，PCR増幅産物に対して，1～10種類の異なる制限酵素処理により，複数の多型が検出できたSTSプライマーが6種類（cMWG733，aMST102，aABG075，MWG2076，MWG631およびMWG913）認められた．ただし，cMWG733，MWG2076およびMWG2076は異なる制限酵素処理により得られた制限酵素断片長多型のパターンはそれぞれで異なるものの，識別ができる品種の組み合わせは同じであった (第2表)．品種間で多型検出数が1つのみの品種の組合せと，その多型を検出するSTSプライマーと制限酵素の組合せは，なす二条とはるな二条間のaABG711とBanIIによる多型，スカイゴールデンとミカモゴールデン間のcMWG694とHaeIIIによる多型，タカホゴールデンとニューゴールデン間のaMST102とHaeIIIによる多型の3組であった．

　これらの結果，24品種全てを識別できる最小のSTSプライマーと制限酵素の組合せを選定し，第2表の左側に○印で示した．その組み合わせは，9種類のSTSプライマーと6種類の制限酵素で，aABG466とEcoO65I，aABG711とBanII，aABG075とPstI，aMST102とEcoT14I，MWG694とHaeIII，cMWG733とPstI，MWG631とEcoO65I，MWG913とEcoT14IおよびMWG2076とHinfIであった (第2表)．

3．RAPD解析
　供試したプライマー53種類の内，1回目の分析結果では19種類のプライマーで多型を検出できたが，再現性が良好で品種識別に利用可能と判断できたのは最終的に6種類であった．これらは，Program Temp Control System PC-808 (ASTEC社製)を用いたPCR反応の結果である．第3表に24品種間で再現性と視認性に優れる多型を検出できたプライマー6種類と，品種間のPCR増幅産物の有無を0，1の数字で区別したものを示した．同一のプライマーにおいて，数字が異なる品種間は，多型が検出され識別が可能であることを示す．これらの6種類のRAPDマーカーを用いることで，供試した24品種は，外国品種2品種を含む11品種 (第3表の*印) と，残りの国内品種13品種を2品種と11品種の2群に分類できた．6種類のプライマーの塩基配列は第4表に示した．

4．SSR解析
供試した50種類のプライマーの組合せのうち，24品種間で多型を検出したプライマーが8種類認められた．しかし，そのうち7種類はPCR増幅断片の品種間の変異が極めて小さく，3.0％アガロースゲルによる品種識別は困難であると判断した．また，PCR増幅産物が無い品種が認められるプライマーがあった．このようなPCR増幅産物の有無による多型は，PCR反応によるDNAの増幅の失敗の可能性が疑われるため，選定から除外した．その結果，PCR反応が良好で，増幅断片の品種間の変異が大きく視認性が優れ，品種識別に適すると判断したプライマーの組合せはBmac0090の1種類のみであった．Bmac0090を用いることで，24品種は5品種と19品種の2群に分類できた (第2表)．Bmac0090はPCR反応液の組成とPCR反応の温度条件がCAPS分析と同じであるため，CAPS分析と同時にPCR反応が可能である．

考察
　本実験では，CAPS分析のみを用いて，国内二条大麦22品種と外国二条大麦2品種の計24品種を識別できる方法を開発した．その他の未知の品種については，本実験の24品種と同じ結果を示す場合，見逃す可能性があるため，識別は現時点では困難である．そのため，品種識別技術の精度や実用性を高めるには，今後，新品種についても継続的にDNAの多型情報を最大限蓄積していくことが重要である．国内二条大麦品種間のDNA多型の検出は，Kaiら (2003) の多型検出情報を利用したにもかかわらず，多型の検出数がCAPS分析による1つのみであった品種の組合せが認められた．そのため，DNA多型を効率的に検出するための分析技術の比較，開発は極めて重要である．また，品種識別に用いるDNAマーカーは，分析操作が簡易で，PCR反応によるDNA断片の増幅が良好で，DNA多型の再現性と視認性が優れ，品種識別能力が高くなければならない．これらの点からみて，CAPS分析が最も優れていた．

　今回，CAPS分析の多型検出頻度が比較的高かったことはKaiら (2003) の結果と一致した．南角ら (2002) は1塩基置換による多型 (SNP) を，国内二条大麦品種のはるな二条と野生オオムギのOUH602間ではあるが，STSプライマーで増幅したDNA断片の塩基配列を調査し，数百塩基ごとに高頻度で検出している．本実験のCAPS分析では制限酵素の種類をKaiら (2003) の10種類より多い16種類用いて検出力を上げたため，SNPの部分の塩基配列を認識する制限酵素により多型を比較的高頻度で検出できたと考えられる．今後は，品種間のSNPによる多型を効率的に簡易に検出する分析方法が有望視される．イネでは，Nasuら (2002) は日本型品種において一塩基伸長法の一種であるAcycloprime FP法を利用して，品種識別に利用性が高く視認性に優れる共優性SNPマーカーを作成する技術を確立している．

　一方，CAPS分析は操作性からみて，RAPDやSSR分析に比べて制限酵素処理のための手間とコストがかかる．しかし，本実験では比較的安価な制限酵素を選定した．また，この品種識別技術は識別の確実性に重点を置いたこと，使用目的として原種圃場や採種圃場の品種の純度管理，流通での偽装防止のための抑止力としての効果を想定していることから，コストと手間は現時点では問題ないと判断した．しかし，今後DNA鑑定が一般的に普及し頻繁に利用されることが考えられ，さらなる低コスト化，操作の簡略化からみた実用性の高い技術の開発と継続的な改良が必要である．

引用文献
赤木守弘 2000．DNA多型によるイネの品種識別．育種学研究 2：89―96．
Blake, T.K, D. Kadqrzhanova, K.W. Shepherd, A.K.M.R. Islam, P.L. Langridge, C.L. McDonald, J. Erpelding, S. Larson, N.K. Blake and L.E. Talbert 1996．STS-PCR markers appropriate for wheat-barley introgression．Theor. Appl. Genet. 93: 826―832．
Kai,H., T.Baba, M. Tsukazaki, Y. Uchimura and M. Furusho 2003．The QTL analysis of hull-cracked grain in Japanese malting barley．Breeding Sci. 53：225－230．
久保貴彦・尾形武文・吉村淳・松江勇次・岩田伸夫 2000．RAPD分析による日本型水稲品種の品種識別．九大農学芸誌55： 5―11．
河野いずみ・竹内善信・島野公利・佐々木卓治・矢野昌裕 2000．DNAマーカーによるイネ日本型品種間の多型検出頻度の比較．育種学研究 2：197―203．
Mano Y., B.E Sayed-Tabatabaei, A. Graner, T. Blake, F. Takaiwa, S. Oka and T. Komatsuda. 1999．Map construction of sequence-tagged sites (STSs) in barley (Hordeum vulgare L.)．Theor. Appl. Genet. 98：937―946．
Matsue, Y., Y. Uchimura, and H. Sato 2002．Confirmation of the productivity of the stored seeds of wheat and two-rowed barley．Plant Prod. Sci. 5：187―193．
　南角奈美・矢野健太郎・佐藤和広・武田和議 2002．大麦のESTに由来するSTS配列の多型性．育種学研究4(別2)：268．
Murray, M.G. and W.F. Thompson 1980．Rapid isolation of high molecular weight plant DNA．Nucleic Acids Res. 8：4321―4325．
Nasu S, J. Suzuki, R. Ohta, K. Hasegawa, R. Yui, N. Kitazawa, L. Monna and Y. Minobe 2002．Search for and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in rice (Oryza sativa, Oryza rufipogon) and establishment of SNP markers．DNA Research 9：163―171．
日本麦類研究会 2002．麦の品種別出回り状況調査（平成13年産）．食糧庁監修　麦研叢書　第202号．23―24．
小笠原博信･高橋砂織 2000．STS-PCR法によるあきたこまち等の1粒品種判別．日本食品科学工学会誌 47：632―637．
大坪研一・藤井剛・橋野陽一・豊島英親・岡留博司・中村澄子・布施隆・川崎信二 1999a．RAPD法による国内産精米の品種判別．日本食品科学工学会誌 46：117―122．
大坪研一・中村澄子・諸岡宏・藤井剛・布施隆・川崎信二 1999b．RAPD法による米飯一粒の品種判別．日本食品科学工学会誌 46：262―267．
Ramsay, L., M. Macaulay, S. degli Ivanissevich, K. MacLean, L. Cardle, J. Fuller, K.J. Edwards, S. Tuvesson, M. Morgante, A. Massari, E. Maestri, N. Marmiroli, T. Sjakste, M. Ganal, W. Powell and R. Waugh 2000. A simple sequence repeat-based linkage map of barley. Genetics 156：1997―2005．
内村要介・佐藤大和・松江勇次 2000．RAPD分析による麦類の品種識別．育種学研究2(別2)：113．

図表のタイトル注一覧
第1表　二条大麦品種間における分析方法の違いによるDNA多型検出数と頻度．
CAPS分析は，17種類の制限酵素処理 (無処理を含む) を行った結果．
  平均は，品種すべての組み合わせについてで，国内22品種間では231組合せ，
外国2　品種と国内22品種間では44組合せの平均値を示す．

第2表　二条大麦品種間におけるCAPSおよびSSRによるDNA多型検出．
同一のプライマーと制限酵素の組合せにおいて，数字が異なる品種間は，
多型が検出され，識別できることを示す．　9つの○印は，24品種を識別
することができる最小のプライマーと制限酵素の組合せの１つの例である．

第3表　二条大麦品種間におけるRAPDによるDNA多型の検出．
Program Temp Control System PC-808 (ASTEC社製)を用いた結果．
＊印の品種は，6種類のプライマーにより，識別が可能であることを示す．

第4表　ランダムプライマーの塩基配列．

第1図　供試した24品種を識別する最小のプライマーと制限酵素の組合せ．
図の下に，プライマー / 制限酵素の組合せを示す．図はいずれも左のレーン
1番目から，1.サイズマーカー(φX174HaeIII，cMWG733のみλHindIIIを含む)，
2.あまぎ二条，3.アサカゴールド，4.ミハルゴールド，5.ほうしゅん，6.九州
二条16号，7.ニシノゴールド，8.ダイセンゴールド，9.きぬゆたか，10.ミサト
ゴールデン，11.スカイゴールデン，12.なす二条，13.おうみゆたか，14.とね
二条，15.みょうぎ二条，16.はるな二条，17.きぬか二条，18.ミカモゴールデ
ン，19.さきたま二条，20.タカホゴールデン，21.ニューゴールデン，22.ニシ
ノチカラ，23.ニシノホシ，24.Harrington，25.Pallas．

以上